酶聯免疫試劑盒復核驗證分析

文│王遠麗（新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州畜產品質量檢測中心）

周俊晟［新疆維吾爾自治區吉木薩爾縣北庭鎮農（牧）業發展服務中心］

筆者對北京勤邦生物技術有限公司（以下簡稱勤邦公司）和北京華安麥科生物技術有限公司（以下簡稱華安麥科）開發的氯霉素酶聯免疫試劑盒展開復核驗證試驗，主要復核指標包括試劑盒的50%抑制濃度、樣本最低檢測限、準確度和精密度。

一、材料和檢測方法

1.試劑。乙酸乙脂、正已烷、去離子水。

2.材料。勤邦公司氯霉素編號：KA00605H酶聯免疫試劑盒（批號為：C190503A10、C201103A10、C210103A10）；華安麥科氯霉素編號：HE09001酶聯免疫試劑盒（批號為：20200312、20201203、20210107）。

3.檢測儀器。微孔板酶標儀450納米/630納米、氮氣吹干裝置、均質器、渦旋儀、離心機、刻度移液管、微量移液器（單道20～200微升、100～1000微升、多道300微升）等。

4.操作方法。根據勤邦公司和華安麥科所提供的試劑盒說明書，對生鮮乳樣本進行試劑盒靈敏度、樣本最低檢測限、準確度和精密度的復核實驗。

5.試劑盒操作過程。

勤邦公司酶聯免疫試劑盒標準曲線濃度分為0、0.025微克/毫升、0.075微克/毫升、0.3微克/毫升、1.2微克/毫升、4.8微克/毫升，樣品前處理過程中稀釋0.5倍；量取2毫升新鮮牛奶樣本至50毫升聚苯乙烯離心管中，分別加入50微升蛋白沉淀劑和8毫升乙酸乙脂，用渦旋儀渦動30秒混勻，3000轉/分鐘，離心5分鐘；吸取4毫升上層有機相至10毫升潔凈干燥玻璃管，于50～60℃（122～140℉）水浴氮氣流下吹干；加入0.5毫升正已烷，用渦旋儀渦動1分鐘，再加入0.5毫升復溶工作液，用渦旋儀渦動30秒，混勻；將所有液體轉移至2毫升聚苯乙烯離心管中，3000轉/分鐘，離心5分鐘；除去上層有機相，取下層水相50微升用于分析。

華安麥科酶聯免疫試劑盒標準曲線濃度分為0、0.01微克/毫升、0.03微克/毫升、0.09微克/毫升、0.27微克/毫升、0.81微克/毫升，樣品前處理過程中稀釋4倍；將生鮮乳樣本于25℃放置1小時左右，待樣本回溫；室溫4000轉/分鐘，離心5分鐘；移去上層脂肪，取500微升下層奶樣，加入1.5毫升生鮮乳樣本稀釋液，振蕩混勻后，取70微升用于分析。

二、復核驗證結果

1.50%抑制濃度測定。測定標準曲線0濃度標準溶液50%抑制率處所對應的藥物濃度IC50值，以此作為評價勤邦公司試劑盒靈敏度、標準曲線及穩定性的性能指標。

驗證過程中，分別測定試劑盒標準曲線6條，用分析軟件計算6條標準曲線IC50值，及IC50波動范圍，結果見表1和表2。

表1 勤邦公司酶聯免疫試劑盒IC50值 微克/毫升

表2 華安公司酶聯免疫試劑盒IC50值 微克/毫升

從測定數據可知，勤邦公司酶聯免疫試劑盒IC50平均值為0.142微克/毫升，波動范圍在0.104～0.187微克/毫升。華安麥科酶聯免疫試劑盒IC50平均值為0.062微克/毫升，波動范圍在0.053～0.067微克/毫升。

2.樣本最低檢測限測定。測定生鮮乳空白樣品，計算最低檢測限。

檢測限計算公式為：LOD＝X＋3×SD。其中，X為重復測定空白樣品的平均值，SD為重復測定空白樣品的標準偏差，其中X為重復測定空白樣品的平均值，n為樣品數量，結果見表3和表4。

表3 勤邦公司酶聯免疫空白生鮮乳樣本最低檢測限 微克/毫升

表4 華安公司酶聯免疫空白生鮮乳樣本最低檢測限 納克/毫升

實驗數據分析，勤邦公司酶聯免疫試劑盒空白生鮮乳樣本最低檢測限為：14.2納克/毫升。華安麥科酶聯免疫試劑盒空白生鮮乳樣本最低檢測限為：82.1納克/毫升。

3.試劑盒準確度和精密度測定。將氯霉素添加至生鮮乳樣本至終濃度分別為0.05微克/毫升、0.1微克/毫升、0.5微克/毫升，每個濃度測定5個重復，對測定結果計算回收率及變異系數，結果見表5和表6。

表5 勤邦公司酶聯免疫試劑盒回收率和變異系數情況 微克/毫升

表6 華安麥科酶聯免疫試劑盒回收率和變異系數情況 微克/毫升

結果表明，勤邦公司酶聯免疫試劑盒空白生鮮乳在三個添加水平的回收率范圍為88.2%～115.3%，批內變異系數范圍為6.3%～9%，批間變異系數為7.7%～8.9%。華安麥科空白酶聯免疫試劑盒生鮮乳在三個添加水平的回收率范圍為78.2%～117%，批內變異系數范圍為5.1%～9.7%，批間變異系數為6%～8%。

三、結果討論

通過對以上復核檢測結果得出：

1.勤邦公司酶聯免疫試劑盒IC50平均值為0.142微克/毫升，波動范圍在0.104～0.187微克/毫升之間。華安麥科酶聯免疫試劑盒IC50平均值為0.062微克/毫升，波動范圍在0.053～0.067微克/毫升。

2.勤邦公司生鮮乳最低檢測限為：14.2納克/毫升。華安麥科生鮮乳最低檢測限為：82.1納克/毫升。

3.勤邦公司酶聯免疫試劑盒空白生鮮乳在三個添加水平的回收率范圍為88.2%～115.3%，批內變異系數范圍為6.3%～9%，批間變異系數為7.7%～8.9%。華安麥科酶聯免疫試劑盒空白生鮮乳在三個添加水平的回收率范圍為78.2%～117%，批內變異系數范圍為5.1%～9.7%，批間變異系數為6%～8%。

4.勤邦公司、華安麥科生產的氯霉素酶聯免疫試劑盒均符合相關要求。