榆干離褶傘溶栓酶對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠肝損傷的保護(hù)作用

李芳芳，張蕊萌，叢 賀，沈明花*

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

酒精性肝病是長(zhǎng)期大量飲酒引起的肝臟損傷性疾病。適量的飲酒可以促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝，但長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)引起肝臟的損傷[1-2]、脂質(zhì)代謝的紊亂及心血管意外的發(fā)生[3-4]。經(jīng)消化道吸收的酒精90%以上在肝臟進(jìn)行代謝[5]，因此肝臟是酒精代謝的主要器官。酒精在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜醄6]，后者進(jìn)一步被氧化成二氧化碳和水。當(dāng)攝入的酒精量超過(guò)機(jī)體的代謝能力時(shí)，酒精及其代謝產(chǎn)物可在體內(nèi)蓄積，引起肝組織的損傷[7-8]。研究表明，酒精代謝紊亂引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是酒精性肝病的主要誘因[9-11]。因此，通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化和抗炎能力，可以抑制或減輕酒精性肝損傷。

榆干離褶傘溶栓酶（Lyophyllum ulmariumfibrinolytic enzyme，LUFE）是從榆干離褶傘菌絲體中分離純化的分子質(zhì)量為50 kDa的溶栓酶[12]，具有抗氧化[13]、抗血栓[14]和抑制血小板活化[15]等作用。前期研究結(jié)果表明，LUFE能夠通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來(lái)抑制酒精誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[13]，并通過(guò)抗炎作用減輕脂多糖引起的大鼠肝組織的損傷[16]。所以推測(cè)LUFE有可能對(duì)酒精性肝損傷也具有保護(hù)作用，其目前鮮見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以酒精誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型探討LUFE對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，為榆干離褶傘的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LUFE由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供。40 只SD大鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2017-0003；使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2020-0010），雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、清蛋白（albumin，Alb）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，T-BIL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）試劑盒 南京建成生物有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-кB）p65抗體、p-NF-κB p65抗體 英國(guó)Abcam公司；抑制性-κBα（inhibitory kappa B-alpha，I-κBα）抗體 上海艾博抗體貿(mào)易有限公司；β-actin抗體 美國(guó) Sigma公司；乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53F光學(xué)顯微鏡 日本OLYMPUS株式會(huì)社；RT-2100型酶標(biāo)儀 深圳雷杜公司；凝交成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將40 只SD大鼠隨機(jī)分為4 組，即正常對(duì)照組、模型組、LUFE低劑量組和LUFE高劑量組，每組10 只。每日上午8時(shí)，除正常對(duì)照組以外的其余組按10 mL/kgmb灌胃體積分?jǐn)?shù)40%的酒精，誘導(dǎo)肝損傷，正常對(duì)照組以等量生理鹽水代替。于每日下午4時(shí)，LUFE低、高劑量組分別按100 mg/kgmb和400 mg/kgmb灌胃LUFE，正常對(duì)照組和模型組以等量生理鹽水代替。連續(xù)灌胃28 d后將大鼠禁食禁水。于次日將大鼠處死，采血并取肝，用于血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)、肝組織形態(tài)學(xué)觀察和Western blot檢測(cè)。

1.3.2 肝組織形態(tài)觀察

取約0.2 g左右的肝組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液固定，將經(jīng)脫水、浸臘、包埋處理后的切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的形態(tài)。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

采用比色法檢測(cè)血清中AST、ALT、Alb、γ-GT、ALP、T-BIL、TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C、T-AOC、SOD及MDA水平，檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血清TNF-α、IL-6水平按酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)肝組織I-κBα和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平

用RIPA裂解液處理肝勻漿液30 min，以4 000 r/min離心10 min后取上清液。將上清液用BCA法蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝交電泳。經(jīng)電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗（I-κBα、NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體），在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日洗滌、加入二抗并室溫孵育2 h，用凝交成像儀進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LUFE對(duì)大鼠肝組織形態(tài)的影響

如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠的肝細(xì)胞排列整齊，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常。經(jīng)酒精誘導(dǎo)以后可見(jiàn)肝細(xì)胞排列紊亂，肝索及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，大量肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，部分肝細(xì)胞發(fā)生壞死等病理改變。與模型組相比，LUFE高、低劑量組肝細(xì)胞的病理?yè)p傷明顯減輕，細(xì)胞排列比較整齊，肝細(xì)胞變性、壞死灶減少，但局部仍可見(jiàn)變性的肝細(xì)胞。

圖1 大鼠肝組織的形態(tài)（200×）Fig.1 Morphology of liver tissues in rats (200 ×)

2.2 LUFE對(duì)大鼠血清AST、ALT活力和Alb水平的影響

AST和ALT在肝細(xì)胞受損時(shí)逸出到血液中，導(dǎo)致血清中其活力升高[17]，因此血清AST和ALT活力可作為肝功能檢測(cè)指標(biāo)[18]。Alb主要在肝臟合成，血清中的Alb質(zhì)量濃度可反映肝功能受損程度[19]。在酒精性肝損傷過(guò)程中細(xì)胞受到ROS和炎癥反應(yīng)的影響，其通透性增加，引起血清ALT、AST水平升高[20]。如表1所示，與正常對(duì)照組比較，模型組的AST和ALT活力極顯著升高，而Alb質(zhì)量濃度極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明酒精引起了肝組織的損傷。與模型組相比，LUFE高劑量組AST和ALT活力極顯著降低（P＜0.01），而Alb質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），提示LUFE對(duì)肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

表1 LUFE對(duì)大鼠血清AST、ALT活力和Alb質(zhì)量濃度的影響Table 1 Effect of LUFE on AST and ALT activity and Alb concentration in the serum of rats

2.3 LUFE對(duì)大鼠血清γ-GT、ALP活力和T-BIL水平的影響

γ-GT活力作為診斷酒精性肝病的較敏感指標(biāo)，在一定程度上可以反映肝細(xì)胞的受損程度。ALP活力是肝臟重要的酶學(xué)指標(biāo)，發(fā)生酒精性肝損傷時(shí)血清中γ-GT和ALP活力明顯升高[21-22]。血紅素代謝過(guò)程中產(chǎn)生的膽紅素經(jīng)肝臟的生物轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素，并隨膽汁排入腸道后進(jìn)一步代謝。當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)肝臟的生物轉(zhuǎn)化能力下降，導(dǎo)致血液中膽紅素含量增多。大量研究表明，酒精所致的肝損傷中T-BIL水平顯著升高[21]。由表2可知，與正常對(duì)照組相比，經(jīng)酒精誘導(dǎo)后模型組大鼠血清γ-GTP、ALP和T-BIL水平極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，LUFE高劑量組γ-GTP、ALP和T-BIL水平均極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明LUFE可以抑制酒精所致的γ-GTP、ALP和T-BIL水平升高。

表2 LUFE對(duì)大鼠血清γ-GT、ALP活力和T-BIL水平的影響Table 2 Effect of LUFE on γ-GT and ALP activity and T-BIL concentration in the serum of rats

2.4 LUFE對(duì)大鼠血清TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C濃度的影響

肝臟是脂類和膽固醇代謝的主要臟器。攝入大量酒精后會(huì)伴有肝臟脂類和膽固醇代謝的異常，這也是酒精性肝損傷的早期表現(xiàn)之一[23-24]。由表3可知，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的TG、T-CHO和LDL-C濃度顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。LUFE高、低劑量組的大鼠血清TG和T-CHO濃度極顯著低于模型組（P＜0.01），說(shuō)明LUFE一定程度上抑制酒精所致的脂類和膽固醇代謝的紊亂。

表3 LUFE對(duì)大鼠TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C濃度的影響Table 3 Effect of LUFE on TG, T-CHO, LDL-C and HDL-C concentrations in the serum of rats

2.5 LUFE對(duì)大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度的影響

酒精刺激肝臟Kupffer細(xì)胞，激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、IL-6等致炎因子的表達(dá)，引起肝細(xì)胞變性、壞死和纖維增生[25]。由表4可知，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01），與Mandrekar等[26]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明酒精或其代謝產(chǎn)物可引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)。與模型組比較，LUFE高劑量組TNF-α、IL-6質(zhì)量濃度極顯著降低（P＜0.01），提示LUFE具有一定的抗炎作用。

表4 LUFE對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度的影響Table 4 Effect of LUFE on TNF-α and IL-6 levels in the serum of rats

2.6 LUFE對(duì)大鼠血清T-AOC、SOD活力及MDA水平的影響

大量酒精被攝入后，其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基會(huì)引起肝細(xì)胞的損傷[27]。體內(nèi)的SOD等抗氧化酶可以清除自由基，從而減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體的自由基水平和脂質(zhì)過(guò)氧化程度[28]。為了研究LUFE對(duì)酒精所致氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了T-AOC、SOD活力和MDA水平。如表5所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清T-AOC、SOD水平極顯著降低，而MDA濃度極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，LUFE高劑量組T-AOC和SOD水平極顯著提高，而MDA濃度極顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明LUFE具有抗氧化作用。

表5 LUFE對(duì)大鼠血清T-AOC、SOD活力及MDA水平的影響Table 5 Effect of LUFE on total antioxidant capacity, superoxide dismutase and malondialdehyde levels in the serum of rats

2.7 LUFE對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

NF-κB是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，參與氧化應(yīng)激、炎癥等反應(yīng)過(guò)程[29]。NF-κB與酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[30]。為了探討LUFE的保肝作用機(jī)制，檢測(cè)了其對(duì)NF-kB信號(hào)通路中的I-κBα蛋白的表達(dá)和NF-κB磷酸化水平的影響。如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組I-κBα相對(duì)表達(dá)量極顯著降低，而NF-κB的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01），提示酒精可激活NF-κB信號(hào)通路。與模型組相比，LUFE高劑量組大鼠肝組織的I-κBα相對(duì)表達(dá)量顯著升高，p-NF-κB相對(duì)表達(dá)量極顯著下降，提示LUFE對(duì)酒精所致NF-κB信號(hào)通路的激活有抑制作用。

圖2 LUFE對(duì)I-κBα和p-NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of LUFE on the expression of I-κBα and p-NF-κB in the liver of rats

3 討 論

攝入大量酒精可引起肝損傷[20,27]。為了觀察LUFE對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，本研究以酒精灌胃的方法建立了大鼠酒精性肝損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)酒精誘導(dǎo)后大鼠的正常肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生肝索排列紊亂、細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、部分細(xì)胞壞死等病理變化。生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清AST、ALT、Alb、γ-TG、T-CHO水平極顯著升高，與肝臟病理形態(tài)改變結(jié)果相符。同時(shí)，模型組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)——MDA水平和促炎因子水平極顯著升高，提示酒精性肝損傷模型建立成功。

本研究結(jié)果表明，LUFE可以減輕酒精或其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的損傷，對(duì)酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。酒精性肝損傷與酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ROS有關(guān)[31]。與模型組相比，LUFE能提高大鼠SOD水平，減少M(fèi)DA的生成，其中LUFE高劑量組改善效果顯著，提示LUFE通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞。酒精性肝損傷除氧化應(yīng)激外，還表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)。酒精及其代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)促炎因子的釋放，從而加劇肝臟的炎癥反應(yīng)[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，高劑量LUFE能極顯著降低TNF-α、IL-6促炎因子的水平，減輕肝臟的炎性損傷，這可能與LUFE對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。在靜息狀態(tài)下，由p50和p65二聚體組成的NF-κB在胞漿中與I-κBα結(jié)合成無(wú)活性的p50-p65-IκB三聚體形式。但在某種誘因的作用下，NF-κB信號(hào)通路中的I-κBα被磷酸化、降解，釋放p65，后者發(fā)生磷酸化并進(jìn)行核轉(zhuǎn)移而被激活，促進(jìn)TNF-α和IL-6等促炎因子的表達(dá)。研究表明，乙醇代謝過(guò)程中生成的乙醛可以激活I(lǐng)-κBα激酶，促進(jìn)I-κBα的磷酸化和降解，從而上調(diào)NF-κB p65的表達(dá)[33]。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，經(jīng)酒精誘導(dǎo)后I-κBα的表達(dá)量降低，NF-κB p65磷酸化水平升高，這與Novitskiy等[33]的研究結(jié)相符。與模型組相比，經(jīng)LUFE干預(yù)后能抑制I-κBα的降解和NF-κB p65磷酸化，提示與模型組相比，LUFE能下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制促炎因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，LUFE干預(yù)會(huì)抑制酒精所致的TG、T-CHO、T-BIL、γ-GT等生化指標(biāo)水平的升高，這可能與LUFE的保肝作用有關(guān)。

綜上，LUFE對(duì)酒精所致的肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎作用有關(guān)。