寬皮柑橘浮皮時脫落酸積累變化及其代謝基因表達特征

賀明陽，洪 敏*，王日葵，喻最新，朱 莉，周 煉，鄧涂靜

（1.西南大學/中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712；2.中國科學院華南植物園植物資源保護與可持續利用重點實驗室，廣東 廣州 510650；3.全國農業技術推廣服務中心，北京 100125）

柑橘是世界上最重要的水果之一，栽培歷史悠久[1]，因其獨特的風味、口感、香氣和多種保健功效廣受消費者喜愛[2]。柑橘果實浮皮是成熟后期或采后衰老過程中普遍發生的一種生理性病害，包裹果肉的囊瓣膜（囊衣）與果皮分離后浮起并產生空隙，常伴隨果實?；涂菟麑嵦撬崞焚|劣變、風味寡淡[3-4]。寬皮柑橘（Citrus reticulataBlanco）是重要的柑橘類水果[5]，產量占中國柑橘總產量的65%，果實浮皮現象嚴重[4]，浮皮的危害程度隨采收期推遲而加劇[6]，是柑橘產業面臨的重要問題。浮皮的發生與采前因素（品種、氣候、果園管理、采收期等）和采后因素（貯藏條件等）有關[3,6]，而浮皮發生的內在機制尚不明確，還需從更多角度進行分析。

研究發現浮皮與內源激素水平變化密切相關。外源赤霉素的施用對柑橘果皮發育具有重要調控作用[7]，能夠調節細胞膜通透性[8]，延緩果實著色，增加果實白皮層的致密性，減少浮皮的發生[9-10]。Ibanez[11]和Martinelli[12]等發現赤霉素信號相關基因在柑橘浮皮果皮中表達受到抑制。張天志[13]利用溫州蜜柑‘宮川’及其耐浮皮‘芽變’為材料進行研究，發現果實發育后期浮皮果白皮層中脫落酸（abscisic acid，ABA）含量高于耐浮皮果。王向陽等[14]發現貯藏期間‘椪柑’枯水果果皮ABA含量始終高于正常果果皮，生長素含量始終低于正常果果皮。陳昆松等[15]發現‘本地早’貯藏過程中果肉ABA含量逐漸降低，果皮ABA積累，果皮生長素水平迅速上升，認為果皮組織衰老遲于果肉，且有二次生長趨勢。本團隊從貯藏30 d后的柑橘果皮中檢測了3 種生長發育相關激素，發現采后果皮大量積累ABA，且浮皮時ABA含量顯著下調。目前浮皮時果皮ABA積累變化尚無定論，涉及不同品種和貯藏期，且采后貯藏過程中ABA代謝基因在浮皮果實中的表達情況尚不清楚，因此探究寬皮柑橘浮皮時ABA積累變化及其代謝基因表達特征具有重要意義。

類胡蘿卜素代謝是ABA生物合成主要途徑[16]。丙酮酸和3-磷酸甘油醛經2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑，由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）催化生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）[17]。GGPP經八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，PSY）、八氫番茄紅素脫飽和酶（phytoene desaturase，PDS）、15-順-ζ-胡蘿卜素異構酶、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）、胡蘿卜素異構酶（carotene isomerase，CRTISO）催化合成全反式番茄紅素[18]。番茄紅素經ε-和β-環化（α-分支）、羥基化生成葉黃素，主要有番茄紅素ε環化酶（lycopeneε-cyclase，LCYE）、番茄紅素β環化酶（lycopeneβ-cyclase，LCYB）、β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase，BCH）、ε-胡蘿卜素羥化酶參與[19]。番茄紅素經β-環化（β-分支）、羥基化和環氧反應生成β-胡蘿卜素、β-隱黃質、玉米黃質、花藥黃質、紫黃質、新黃質，主要有LCYB、BCH、玉米黃質環氧酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）、紫黃質脫環氧酶（violaxanthin de-epoxidase，VDE）、新黃質合成酶參與[20]。辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶（capsanthin-capsorubin synthase，CCS）可催化花藥黃質、紫黃質分別生成辣椒紅素和辣椒玉紅素，辣椒紅素經ZEP催化生成辣椒玉紅素[17]。β-胡蘿卜素經類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）催化合成獨腳金內酯[21-22]。紫黃質和新黃質經9-順-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）催化合成ABA前體物質黃質醛[16,23]。ABA分解代謝主要由脫落酸8’-羥化酶（abscisic acid 8’-hydoxylase，AB1）催化[24]。MYB68、ABF3轉錄因子調控ABA代謝[25-26]。

‘克里曼丁’和‘椪柑’寬皮柑橘類采后易發生浮皮，因此，本研究以貯藏30 d的兩個柑橘品種為材料，運用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR）技術，解析浮皮與正常果皮ABA、類胡蘿卜素組分含量的差異以及ABA代謝基因表達特征。研究結果有助于揭示柑橘浮皮發生的內在機制，為柑橘采后浮皮防控技術研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘克里曼丁’和‘椪柑’果實于2018年采自國家柑橘種質資源圃（重慶北碚）。采摘大小一致、色澤均勻、無機械損傷、無病蟲害、九成熟的果實為材料。

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441） 天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒（RR047A）、SYBR?Premix ExTaq? II（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒（RR820A） 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

HPLC-MS/MS儀 美國Waters公司；高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；H1850R臺式高速冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；YGC-16A全自動氮吹濃縮儀 鄭州寶晶電子科技有限公司；CFX96TM實時熒光定量PCR儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

用500 mg/L咪鮮胺浸泡果實30 s，撈出瀝干，用聚乙烯薄膜袋單果包裝。處理后的果實置于溫度18～20 ℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏。貯藏30 d后選擇浮皮程度一致的果實為浮皮樣品，正常果實為對照組樣品（圖1）。15 個果實為一組，設3 組重復，分別取1/4果皮用液氮速凍，混合粉碎后于-80 ℃保存備用。

圖1 柑橘貯藏30 d后正常和浮皮果實的縱切面圖Fig.1 Longitudinal section of normal mandarins and those with peel puffing after 30 d storage

1.3.2 果實浮皮指數及果皮水分質量分數的測定

100 個果實為一組，設3 組重復，進行果實浮皮指數和果皮水分質量分數測定。果實浮皮指數測定參考石學根等[27]的方法。用1 cm直徑的打孔器在每個果實的果皮對角線上各打一個孔，采用直接干燥法測定果皮水分質量分數。

1.3.3 果皮脫落酸含量的測定

脫落酸含量測定參考Pan Xianqing等[28]的方法。選用外標法進行定量分析。稱取50 mg研磨成粉末的樣品，加入0.5 mL提取液（異丙醇、去離子水、濃鹽酸體積比為2∶1∶0.002），低溫超聲30 min，然后加入1 mL二氯甲烷，低溫超聲30 min。4 ℃、13 000×g離心5 min，吸取底層溶液在氮吹儀中濃縮。最后取0.1 mL甲醇溶解濃縮樣品，用直徑0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC-MS/MS檢測。實驗重復3 次。

HPLC條件：C18柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相A（體積分數0.1%甲酸溶液）、流動相B（0.1%甲酸-甲醇溶液）；進樣量為5 μL；流速為0.3 mL/min。MS條件：離子噴霧電壓-4 500 V、離子源溫度500 ℃、氣簾氣壓強40 psi、霧化氣壓強45 psi、輔助氣壓強30 psi。

1.3.4 類胡蘿卜素組分及含量的測定

類胡蘿卜素提取、皂化參考陳細羽等[29]的方法，用直徑0.22 μm濾膜過濾后上機。實驗重復3 次。色譜條件：YMC類胡蘿卜素C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動相為甲醇-甲基叔丁基醚（體積比70∶30）；進樣量為20 μL；流速為1 mL/min；檢測波長為450 nm。

1.3.5 ABA代謝基因相對表達量的測定

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒操作說明書提取柑橘果皮總RNA，然后利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

柑橘ABA代謝基因引物序列參考Zhu Feng[25]、Rodrigo[30]、Wang Lu[31]等的設計。采用SYBR染料法測定基因表達水平，參照SYBR?Premix ExTaq? I（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒的說明操作，利用qPCR儀進行測定。反應體系如下：10 μL SYBR Green I mix、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物、1.5 μL cDNA模板、6.9 μL ddH2O。兩步法PCR反應程序如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，40 個循環。融解曲線繪制：95 ℃、10 s，降溫到65 ℃后開始以0.5 ℃每步升溫，并維持5 s采集熒光信號，反應至95 ℃結束。實驗重復3 次。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.4 數據處理與分析

數據利用Microsoft Excel 2007軟件進行統計處理，選用SPSS 20軟件執行Duncan法進行顯著性分析（P＜0.05）和Pearson相關性分析（P＜0.05），采用Origin 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏期間柑橘果實浮皮指數和果皮水分質量分數的變化

如表1所示，貯藏30 d后‘克里曼丁’和‘椪柑’果實浮皮指數顯著增加，分別提高了177%和186%；果皮水分質量分數也顯著上升，分別提高了5.9%和14.4%。

表1 ‘克里曼丁’和‘椪柑’貯藏前后果實浮皮指數和果皮水分質量分數的變化Table 1 Changes in peel puffing indexes and peel water contents in‘Clementine’ and ‘Ponkan’ fruits after storage

2.2 浮皮對柑橘果實果皮ABA含量的影響

柑橘果實采后貯藏過程是一個自身消耗引起的衰老過程，受ABA調控[32]。如圖2所示，‘克里曼丁’和‘椪柑’果實正常果皮的ABA含量分別為1 659.2、464.6 ng/g，浮皮果實果皮ABA含量分別顯著下降至795.1、230.5 ng/g，為正常果皮的47.9%、49.6%?！死锫　Ｅc浮皮果實的果皮ABA含量均高于‘椪柑’，其中正常果皮ABA含量為‘椪柑’正常果皮的3.57 倍，浮皮果實果皮ABA含量為‘椪柑’浮皮果實果皮的3.45 倍。

圖2 ‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮時果皮ABA含量的變化Fig.2 Changes in abscisic acid contents in ‘Clementine’ and ‘Ponkan’fruits after peel puffing

2.3 浮皮對柑橘果實果皮類胡蘿卜素組分含量的影響

如圖3所示，‘克里曼丁’和‘椪柑’果皮中主要積累β-隱黃質。對于‘克里曼丁’柑橘，正常果皮和浮皮果實果皮中總類胡蘿卜素含量分別為378.8、295.9 μg/g，浮皮果實果皮總類胡蘿卜素含量顯著降低，為正常果皮的78.1%；浮皮果實果皮β-胡蘿卜素、β-隱黃質、葉黃素、辣椒紅素含量顯著降低，分別為8.7、248.8、3.8、14.5 μg/g，分別為正常果皮的85.2%、76.6%、70.1%、68.1%；浮皮果實果皮紫黃質、新黃質含量顯著增加，分別為9.6、5.9 μg/g，為正常果皮的127.9%、138.4%。玉米黃質含量為4.6 μg/g，與正常果皮無顯著差異。

圖3 ‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮時果皮類胡蘿卜素及其組分含量的變化Fig.3 Changes in contents of total and individual carotenoids in‘Clementine’ and ‘Ponkan’ fruits after peel puffing

對于‘椪柑’，正常果皮和浮皮果實果皮中總類胡蘿卜素含量分別為809.9、859.6 μg/g，浮皮時總類胡蘿卜素含量雖有增加，但與正常果皮無顯著差異；浮皮果實果皮β-胡蘿卜素、辣椒紅素含量顯著降低，分別為22.1、42.6 μg/g，分別為正常果皮的80.8%、79.0%；浮皮果實果皮β-隱黃質、玉米黃質、紫黃質、新黃質含量顯著增加，分別為754.3、11.8、7.4、3.1 μg/g，分別為正常果皮的109.0%、118.1%、117.6%、133.2%；浮皮果實果皮葉黃素含量為18.1 μg/g，與正常果皮無顯著差異。

Pearson相關性分析發現，兩個柑橘品種浮皮時果皮ABA含量與β-胡蘿卜素、辣椒紅素含量呈顯著正相關（P＜0.05），與新黃質、紫黃質含量呈顯著負相關（P＜0.05）。

2.4 浮皮對柑橘果實果皮ABA生物合成基因表達水平的影響

如圖4所示，在ABA生物合成途徑中共檢測了15 個基因的相對表達量。對于‘克里曼丁’柑橘，浮皮果實果皮GGPPS、LCYB1、NCED2、NCED5相對表達量顯著降低，分別為正常果皮的87.6%、92.3%、83.8%、92.8%；PSY、PDS、ZDS、LCYE、LCYB2、ZEP、CCD4、CCS相對表達量顯著增加，分別為正常果皮的103.7%、107.4%、109.2%、120.3%、118.6%、128.0%、176.7%、129.2%；CRTISO、BCH2、VDE相對表達量與正常果皮無顯著差異。

圖4 ‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮時果皮ABA生物合成基因表達水平的變化Fig.4 Changes in expression patterns of genes involved in ABA biosynthesis in ‘Clementine’ and ‘Ponkan’ fruits after peel puffing

對于‘椪柑’，浮皮果實果皮PSY、LCYB1、BCH2、VDE、CCD4相對表達量顯著降低，分別為正常果皮的84.4%、70.4%、70.1%、79.4%、52.7%；PDS、LCYE、LCYB2、ZEP、CCS相對表達量顯著增加，分別為正常果皮的111.3%、108.2%、134.7%、145.4%、143.5%；GGPPS、ZDS、CRTISO、NCED2、NCED5相對表達量與正常果皮無顯著差異。

Pearson相關性分析發現，兩個柑橘品種浮皮時果皮ABA含量與LCYB1相對表達量呈顯著正相關（P＜0.05），與LCYE、LCYB2、ZEP、CCS相對表達量呈顯著負相關（P＜0.05）。

2.5 浮皮對柑橘果實果皮ABA分解相關基因表達水平的影響

如圖5所示，‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮果實果皮AB1表達水平顯著上調，分別為正常果皮的156.3%、128.3%；MYB68表達水平顯著下調，分別為正常果皮的12.4%、44.9%；ABF3表達水平與正常果皮無顯著差異。Pearson相關性分析發現，兩個柑橘品種浮皮時果皮ABA含量與MYB68表達量呈顯著正相關（P＜0.05），與AB1表達量呈顯著負相關（P＜0.05）。

圖5 ‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮時果皮ABA分解及相關轉錄因子表達水平的變化Fig.5 Changes in expression patterns of genes involved in ABA decomposition and related transcriptional factors in ‘Clementine’ and‘Ponkan’ fruits after peel puffing

3 討 論

寬皮柑橘采后貯藏過程中浮皮現象嚴重，隨著貯藏期延長，浮皮癥狀加重。本研究以‘克里曼丁’和‘椪柑’為試材，發現貯藏過程中浮皮指數顯著增加，浮皮程度加劇，鄭小華等[33]也發現類似結果。寬皮柑橘果皮和果肉之間有空隙且有發達的橘絡（維管束），而緊皮柑橘白皮層和囊衣緊密貼合[32]。貯藏過程中‘克里曼丁’和‘椪柑’果皮水分質量分數顯著上升，可能是貯藏過程中果皮響應外界逆境需消耗能量，果肉通過發達的維管束系統將大量水分運輸至果皮，以此維持生理穩定[32]。

目前對于浮皮發生的機理存在分歧，除了推測浮皮的發生是因為果皮早衰外[34]，也有推測是果肉與果皮衰老不一致及果皮相對二次生長所致[15]，其他推測還包括果肉營養物質向果皮轉移[32,35]。研究發現‘克里曼丁’和‘椪柑’浮皮時果皮ABA含量顯著降低，表明浮皮的發生可能是由果皮衰老相對延遲所致。ABA生物合成主要通過類胡蘿卜素代謝途徑[16]。經Pearson相關性分析發現，兩個柑橘品種浮皮時果皮ABA含量與β-胡蘿卜素、辣椒紅素、紫黃質、新黃質含量及LCYE、LCYB1、LCYB2、ZEP、CCS、MYB68、AB1表達量顯著相關。浮皮時，β-胡蘿卜素含量顯著降低，抑制了ABA合成，其中LCYB1表達量顯著降低，LCYB2表達量顯著增加，說明浮皮時ABA合成主要受LCYB1調控。浮皮時LCYE表達量顯著增加，可能促進了α-分支類胡蘿卜素積累，相對抑制了β-胡蘿卜素積累，從而引起ABA含量下降。前人研究發現沉默LCYE基因后，早實枳葉片中α-胡蘿卜素含量下降，β-胡蘿卜素含量增加[36]。浮皮時，CCS表達量增加而辣椒紅素積累減少，可能與ZEP表達量上升致使辣椒紅素環氧化生成辣椒玉紅素有關[17]。浮皮時，ZEP表達量上升也促進了紫黃質合成。王寧[37]發現過量表達ZEP的番茄葉片玉米黃質、花藥黃質含量降低，而紫黃質含量增加。紫黃質和新黃質經NCED酶催化生成ABA前體物質黃質醛，該過程是ABA生物合成的關鍵步驟[23]。浮皮時，紫黃質、新黃質含量顯著增加，而ABA積累顯著降低，原因可能是NCED活力低或AB1表達量顯著上升加快了ABA分解。在擬南芥和大麥吸脹種子中發現AB1表達量上調伴隨著ABA含量減少[38]。MYB68通過負調控BCH2和NCED5的表達，來負調節類胡蘿卜素轉化和ABA生物合成[25]。但本研究中兩個柑橘品種浮皮時MYB68表達量與ABA含量均顯著下調，與Zhu Feng等[25]的研究結果不一致，故基因MYB68的功能還需進一步研究。

ABA積累由其生物合成和分解代謝決定[38]。綜合分析認為，兩個柑橘品種浮皮時ABA生物合成途徑中β-胡蘿卜素含量下降及ABA分解加快共同導致ABA含量降低，其中LCYB1、LCYE、AB1發揮重要作用。本研究基于前期研究結果，探究寬皮柑橘浮皮發生過程中ABA積累變化機制及其代謝基因表達特征，而柑橘浮皮是個復雜的過程，還需從多品種、全基因組水平進行系統分析。

4 結 論

本研究發現‘克里曼丁’和‘椪柑’果實在貯藏過程中浮皮指數和果皮水分質量分數均顯著增加，表明采后果實浮皮程度加劇，且存在水分轉移至果皮的現象。進一步分析發現，與正常果皮相比，兩個柑橘品種浮皮時果皮ABA含量顯著降低，ABA積累下調與β-胡蘿卜素合成降低及ABA分解加快有關，主要有LCYB1、LCYE、AB1協同作用。本研究揭示了柑橘果實浮皮的發生可能是由果皮衰老相對延遲所致，闡明了浮皮時ABA積累變化及其代謝基因表達特征。本研究結果有助于揭示浮皮發生的內在機制，為柑橘采后浮皮防控技術研發提供理論依據。