黑豆糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析及抗氧化和免疫活性

胡懿化，王星滟，張武霞,*，岳愛琴，杜維俊，趙晉忠，李 鵬,*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

糖蛋白是由寡糖鏈與多肽鏈通過共價鍵相連而構(gòu)成的糖綴合物[1]。糖肽鍵是糖鏈和肽鏈之間的連接鍵。糖蛋白結(jié)構(gòu)中，糖的半縮醛羥基和含羥基的絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸等氨基酸之間連接的共價鍵是O-糖肽鍵；而糖的半縮醛羥基和天冬酰胺的酰胺基之間連接的共價鍵是N-糖肽鍵[2]。糖蛋白因其結(jié)構(gòu)而同時具有糖和蛋白質(zhì)兩者的性質(zhì)，是動植物和微生物的重要組成物質(zhì)，也是生物體內(nèi)細胞通訊、免疫調(diào)控等生命現(xiàn)象不可或缺的生物大分子[3]。已有研究報道，天然糖蛋白具有增強機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂等藥理作用[4-5]，因此天然活性糖蛋白的獲取一直是開發(fā)藥物、功能性食品及保健品的研究熱點。

黑豆是一種營養(yǎng)價值豐富且藥用價值極高的植物[6]。在民間流傳的許多古方中記載，藥黑豆具有補腎補血、清熱解毒、活血化瘀和明目延年等功效[7]。目前關(guān)于黑豆多酚[8]、花青素[9]、類黃酮[10]和皂苷[11]等小分子化合物的活性研究報道較多，但缺乏黑豆糖蛋白結(jié)構(gòu)和活性的研究。本研究對兩種純化后的黑豆糖蛋白的結(jié)構(gòu)組成、抗氧化活性及免疫活性進行初步探究，以期為黑豆的功能研究提供理論參考，同時為其產(chǎn)品的開發(fā)提供可靠數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C57BL/6小黑鼠購自中國山西醫(yī)科大學(xué)，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(晉)2020-0003，動物使用許可證號：SYXK(晉)2019-0001；太谷‘青仁黑豆1號’產(chǎn)于中國山西省太谷區(qū)。

D-葡萄糖（純度≥99%）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、間羥基聯(lián)苯、K3Fe(CN)6溶液、磷酸鈉、鉬酸銨、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）上海阿拉丁公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胎牛血清 杭州四季青公司；DEAE-52纖維素、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 北京索萊寶生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-1800型分光光度計 上海精科儀器廠；1260型液相色譜儀 美國安捷倫公司；S-433D型氨基酸分析儀 德國Sykam公司；DNM-9602型酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Galaxy 170S型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱英國New Brunswick公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆糖蛋白的提取、分離及其純化

分離純化步驟如圖1所示，采用堿提沉醇法制備黑豆糖蛋白粗品。首先將黑豆粉碎成末，加入95%（體積分數(shù)，下同）乙醇溶液，80 ℃加熱回流2 h脫脂。抽濾收集的殘渣加水，然后在80 ℃水浴鍋中提取2 h，抽濾分離濾液，重復(fù)操作3 次。所得濾渣在50 ℃下用0.2 mol/L NaOH溶液提取2 h，收集濾液，重復(fù)操作3 次，合并濾液，進行濃縮。向濃縮后的濾液中加入4 倍體積的95%乙醇溶液，低溫條件下使糖蛋白完全沉淀，將收集的沉淀溶解透析后凍干，得到糖蛋白粗品（HDJ）。然后采用Cl-型DEAE-52纖維柱（5 cm×50 cm）分離純化，用蒸餾水，0.1 mol/L、0.2 mol/L和0.5 mol/L NaCl溶液以0.5 mL/min的流速依次洗脫，并根據(jù)糖含量收集0.2 mol/L和0.5 mol/L NaCl洗脫組分。再采用Sephadex G-100凝交過濾層析柱（柱料粒徑：40～120 μm）進一步純化上述0.2 mol/L和0.5 mol/L NaCl洗脫組分，分別用蒸餾水以0.2 mL/min的流速洗脫，硫酸-苯酚法跟蹤檢測不同試管糖含量，收集純化得到兩種純黑豆糖蛋白，分別命名為HDJS2和HDJS5-2。

圖1 黑豆糖蛋白HDJS2和HDJS5-2的提取純化流程Fig.1 Flow chart for the extraction and purification of glycoproteins HDJS2 and HDJS5-2 from black soybeans

1.3.2 糖蛋白分子質(zhì)量及化學(xué)組分的測定

1.3.2.1 分子質(zhì)量的測定

黑豆純糖蛋白HDJS2和HDJS5-2的分子質(zhì)量通過高效凝交滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）[12]測定。3 根Waters色譜柱串聯(lián)（型號：Ultrahydrogel Columns 250、1000和2000；300 mm×7.8 mm，6 μm），3 mmol/L乙酸鈉溶液作為流動相，流速保持在0.5 mL/min，進樣量為50 μL。用6 種不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（5.2、11.6、23.8、48、148、668 kDa）校準(zhǔn)色譜柱，lgMw與洗脫時間（t/min）的校準(zhǔn)曲線如式（1）所示。根據(jù)樣品的保留時間，利用式（1）來定量計算HDJS2和HDJS5-2的分子質(zhì)量/Da。

1.3.2.2 化學(xué)組分的測定

D-葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-苯酚法[13]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定HDJS2和HDJS5-2的中性糖相對含量。牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，考馬斯亮藍法[14]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定HDJS2和HDJS5-2中的蛋白質(zhì)相對含量。采用間羥基聯(lián)苯比色法[15]測定黑豆糖蛋白中糖醛酸的相對含量，GalA作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算HDJS2和HDJS5-2中的糖醛酸相對含量。

1.3.2.3 單糖組成分析

以8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、GalA、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）（純度≥99%）作為對照，采用柱前PMP衍生法，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進行分析[16]。待測樣品HDJS2和HDJS5-2加水預(yù)溶，加入4 mol/L TFA 110 ℃水解4 h，冷卻后加甲醇除去多余的TFA至無酸味，蒸餾水溶解得到多糖水解液。向上述處理好的樣品水解液或單糖混合液中加入0.6 mol/L氫氧化鈉溶液充分混合，加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，振蕩混勻并在70 ℃水浴反應(yīng)100 min。反應(yīng)混合物用0.3 mol/L鹽酸中和后用氯仿提取3 次，0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜儀1260檢測。色譜條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫20 ℃；紫外檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min。進樣體積：20 μL。流動相由兩種溶液的梯度洗脫組成（A相：15%乙腈+85%磷酸鹽緩沖液；B相：40%乙腈+60%磷酸鹽緩沖液）。對照標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)出峰時間確定單糖種類，根據(jù)峰面積計算單糖含量。

1.3.2.4 氨基酸分析

采用全自動氨基酸分析儀對黑豆糖蛋白中水解氨基酸的種類及含量進行測定[17]。準(zhǔn)確稱取2 mg待測樣品于10 mL水解管中；加入6 mol/L鹽酸2 mL，充入高純氮氣1～2 min；移開氮氣后立即蓋好并擰緊蓋子。將水解管置于（110±1）℃恒溫烘箱中水解22 h；水解完成后冷卻混勻，將水解液過濾、定容至10 mL。吸取1 mL樣液于圓底燒瓶內(nèi)，在45 ℃條件下抽真空濃縮，殘留物用樣品稀釋液溶解稀釋，振蕩混勻，用0.22 μm濾膜過濾后，上機測定。

S433-D氨基酸分析儀檢測系統(tǒng)分析條件：固定相：Na+型磺酸基陽離子交換樹脂；流動相：四元梯度混合系統(tǒng)（A相：pH 3.45的檸檬酸鈉緩沖液；B相：pH 10.85的檸檬酸鈉緩沖液；C相：5%甲醇溶液；再生液：2% NaOH溶液）；柱溫：58 ℃；紫外檢測波長：570 nm和440 nm；流速：0.45 mL/min；進樣體積：0.1 mL。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

采用KBr壓片法對系列黑豆純糖蛋白進行傅里葉變換紅外光譜分析[18]。將HDJS2和HDJS5-2置于常壓干燥器中過夜。分別取干燥的HDJS2和HDJS5-2按1∶100的質(zhì)量比與KBr粉末混勻、研磨后壓片，Spectrom Two傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1的波長范圍內(nèi)進行掃描，并記錄吸收峰。

1.3.4 黑豆糖蛋白糖肽鍵的鑒定

糖肽鍵類型的判斷主要采用β-消除反應(yīng)[19]，用0.2 mol/L NaOH溶液處理HDJS2和HDJS5-2，45 ℃反應(yīng)30 min，冷卻后在240 nm波長處測定NaOH處理前后樣品的吸光度。

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

1.3.5.1 總還原力的測定

參考文獻[20]評估樣品作為還原劑在氧化還原反應(yīng)中的抗氧化活性。用蒸餾水配成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、8 mg/mL的樣品溶液，加入0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和質(zhì)量分數(shù)1% K3[Fe(CN)6]溶液混勻，在50 ℃下反應(yīng)20 min后，加入質(zhì)量分數(shù)為10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。取上清液并加入等體積的超純水和質(zhì)量分數(shù)為0.1%三氯化鐵溶液混勻。室溫下反應(yīng)15 min后，測定700 nm波長處的吸光度。

1.3.5.2 總抗氧化能力的測定

參考文獻[21]根據(jù)反應(yīng)體系的顏色變化來測定HDJS2和HDJS5-2的抗氧化能力。配制不同質(zhì)量濃度的樣品（0.5、1、2、4、8 mg/mL）。配制磷鉬試劑：稱取2.660 8 g磷酸鈉（Na3PO4·12H2O）和1.235 7 g鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·4H2O]，放入燒杯中，并緩緩加入8.2 mL濃硫酸使之充分溶解，然后用蒸餾水定容至250 mL備用。取1 mL待測樣品溶液和6 mL磷鉬試劑于試管中，快速混勻并在95 ℃恒溫水浴反應(yīng)90 min。測定并記錄735 nm波長處的吸光度。

1.3.5.3 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除實驗被廣泛用于評估植物提取物的自由基清除活性[22]。用質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇溶液配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，分別向1 mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1、2、4、8 mg/mL）的HDJS2和HDJS5-2中加入4 mL DPPH溶液，振蕩，使其充分混勻。室溫條件下反應(yīng)30 min后在517 nm波長處測定吸光度。蒸餾水代替樣品為空白組，DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：A樣品為1 mL不同濃度的樣品和DPPH溶液反應(yīng)后在570 nm波長處的吸光度；A空白為1 mL蒸餾水和4 mL DPPH溶液在570 nm波長處的吸光度。

1.3.6 脾細胞增殖實驗

1.3.6.1 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備

無菌操作取出小鼠脾臟，在100 目不銹鋼網(wǎng)上用5 mL注射器活塞輕輕地研磨脾臟，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后加入紅細胞裂解液，1 000 r/min離心5 min，離心后用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩次，獲得的單細胞懸液用含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.6.2 黑豆糖蛋白對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

根據(jù)Mosmann[23]概述的MTT法體外評估黑豆糖蛋白對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。ConA和LPS作為刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞的有絲分裂原。將按上述方法獲得的小鼠脾淋巴細胞懸液，置于96 孔板中孵育，密度為1×107個/mL，實驗組包括單獨刺激組：分別加入不同質(zhì)量濃度（50、100、200 μg/mL）的HDJS2和HDJS5-2單獨作用，設(shè)置磷酸鹽緩沖液空白對照和ConA、LPS兩個陽性對照；ConA協(xié)同組：用不同質(zhì)量濃度的（50、100、200 μg/mL）HDJS2和HDJS5-2與ConA（5 μg/mL）協(xié)同作用，設(shè)置ConA對照；LPS協(xié)同組：用不同質(zhì)量濃度（50、100、200 μg/mL）的HDJS2和HDJS5-2與LPS（5 μg/mL）協(xié)同作用，設(shè)置LPS對照。設(shè)置6 個復(fù)孔，在37 ℃條件下孵育48 h后，加入MTT（5 mg/mL），再繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定OD值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析及繪圖。差異顯著性采用t-檢驗分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆糖蛋白成分分析結(jié)果

2.1.1 化學(xué)組分分析

黑豆糖蛋白的分子質(zhì)量及化學(xué)組分相對含量如表1所示，HDJS2和HDJS5-2主要是由蛋白質(zhì)和中性糖組成，含有少量的糖醛酸，其中蛋白質(zhì)含量最高。HDJS5-2的中性糖含量、蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量均高于HDJS2。如圖2所示，根據(jù)待測樣品的保留時間，代入公式（1）計算得到HDJS2的分子質(zhì)量為3.20×104Da、HDJS5-2的分子質(zhì)量為3.89×104Da。

表1 HDJS2和HDJS5-2分子質(zhì)量及組分相對含量Table 1 Molecular masses and components of HDJS2 and HDJS5-2

圖2 HDJS2和HDJS5-2的高效液相色譜圖Fig.2 HPGPC chromatograms of HDJS2 and HDJS5-2

2.1.2 單糖組成分析結(jié)果

如圖3所示，單糖組成分析結(jié)果表明，HDJS2主要由Man、Glc、Gal、Ara和Fuc組成，對應(yīng)物質(zhì)的量比為17.754∶33.951∶18.240∶16.321∶4.407。HDJS5-2主要由Man、Glc、Gal和Ara組成，對應(yīng)物質(zhì)的量比為50.001∶4.688∶11.908∶10.741。

圖3 PMP衍生物色譜圖Fig.3 Chromatograms of PMP derivatives of HDJS2 and HDJS5-2

2.1.3 氨基酸分析結(jié)果

通過全自動氨基酸分析儀檢測分析HDJS2和HDJS5-2所含氨基酸的種類和相對含量，結(jié)果如表2所示。HDJS2和HDJS5-2兩個組分中均含有17 種氨基酸，其中7 種人體必需氨基酸，總相對含量分別為31.3%和17.4%；10 種非必需氨基酸，總相對含量分別為64.8%和53.9%。此外HDJS2和HDJS5-2還含有7 種藥用氨基酸。HDJS2的氨基酸相對含量比HDJS5-2高，兩者總相對含量分別為96.1%和71.3%。谷氨酸和天冬氨酸為主要氨基酸。

表2 黑豆糖蛋白氨基酸組成及相對含量Table 2 Amino acid composition of HDJS2 and HDJS5-2%

2.2 黑豆糖蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

如圖4所示，在傅里葉變換紅外光譜圖3 300 cm-1左右處，HDJS2和HDJS5-2兩個純糖蛋白都出現(xiàn)了一個較寬的吸收峰，這是羥基的伸縮振動而產(chǎn)生的吸收峰，說明該組分中具有羥基官能團；在2 960 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰由—CH伸縮振動引起，這說明HDJS2和HDJS5-2具有糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)[24]。在1 660 cm-1和1 240 cm-1附近分別出現(xiàn)了α-螺旋和β-折疊的特征吸收峰，說明這兩個黑豆糖蛋白具有蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[25]。在1 650 cm-1處HDJS5-2的吸收峰面積比HDJS2大，這說明HDJS5-2結(jié)構(gòu)中酰胺鍵數(shù)量比HDJS2多，所以HDJS5-2的蛋白質(zhì)含量比HDJS2組分的蛋白質(zhì)含量高，這與上述蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果一致。1 000～1 200 cm-1附近的吸收峰顯示有吡喃糖環(huán)。

圖4 HDJS2（A）和HDJS5-2（B）的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 Fourier transform infrared spectra of HDJS2 (A) and HDJS5-2 (B)

2.2.2 糖肽鍵的鑒定

在堿性條件下，O-糖肽鍵發(fā)生β-消除反應(yīng)，與糖鏈相連的絲氨酸轉(zhuǎn)化形成不飽和脂肪酸，在240 nm波長處的吸光度發(fā)生明顯的變化，從而鑒定HDJS2和HDJS5-2的糖肽鍵類型。NaOH處理后，HDJS2和HDJS5-2在240 nm波長處的吸光度均發(fā)生了明顯的變化（表3），這說明HDJS2和HDJS5-2的糖肽鍵類型均為O-糖肽鍵。

表3 HDJS2和HDJS5-2 β-消除反應(yīng)前后吸光度的變化Table 3 Changes in absorbance of HDJS2 and HDJS5-2 before and after β-elimination reaction

2.3 抗氧化活性分析結(jié)果

通過體外實驗評估黑豆糖蛋白HDJS2和HDJS5-2的抗氧化活性，結(jié)果如圖5所示。吸光度越高，表明樣品的總還原能力和總抗氧化能力越強。如圖5A和5B所示，隨著糖蛋白質(zhì)量濃度的增加，HDJS2和HDJS5-2的總還原能力和總抗氧化能力不斷增強，后者的總還原力和總抗氧化能力明顯強于前者。

圖5 HDJS2和HDJS5-2的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of HDJS2 and HDJS5-2

黑豆糖蛋白的DPPH自由基的清除能力如圖5C所示。HDJS2和HDJS5-2的質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達到8 mg/mL時，HDJS2和HDJS5-2的DPPH自由基清除率達到最高，分別是71%和55%。此外，HDJS2的DPPH清除能力明顯高于HDJS5-2的DPPH自由基清除能力。

2.4 黑豆糖蛋白對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

脾淋巴細胞的增殖也是機體發(fā)揮免疫調(diào)控作用的重要環(huán)節(jié)之一。HDJS2和HDJS5-2單獨刺激脾細胞時，脾淋巴細胞增殖呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，HDJS2明顯比HDJS5-2的促增殖效果好（圖6A），這可能與兩者氨基酸和單糖的組成及含量不同有密切的關(guān)系。LPS與HDJS2或HDJS5-2協(xié)同刺激小鼠脾淋巴細胞增殖的效果不明顯（圖6B）。ConA協(xié)同刺激組均低于ConA對照組（圖6C），這說明HDJS2和HDJS5-2分別與ConA共同作用時，反而會抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖。

圖6 HDJS2和HDJS5-2對脾細胞增殖的影響Fig.6 Effects of HDJS2 and HDJS5-2 on splenocyte proliferation

3 討 論

糖蛋白來源豐富、種類繁多，在科研及食品醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用十分廣泛。天然糖蛋白是動物和植物體內(nèi)的重要大分子物質(zhì)，也是動植物體內(nèi)的通訊媒介，因其糖蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，所以在細胞信號傳遞過程中有著極為復(fù)雜的作用[26-27]。本實驗對兩種黑豆糖蛋白（HDJS2、HDJS5-2）的結(jié)構(gòu)特征、抗氧化活性及免疫活性進行研究，理化和光譜分析結(jié)果表明，HDJS2（3.2×104Da）和HDJS5-2（3.89×104Da）是O-型糖肽鍵連接的糖蛋白，含有α-螺旋和β-折疊蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。HDJS2糖鏈部分主要是由Man、Glc、Gal、Ara和Fuc組成；而HDJS5-2糖鏈部分主要由Man、Glc、Gal和Ara組成。HDJS2和HDJS5-2均含有17 種氨基酸，7 種必需氨基酸總相對含量占總氨基酸的32.6%和24.4%，研究表明西藏不同產(chǎn)地的冬蟲夏草必需氨基酸相對含量僅占總氨基酸的26.47%～27.52%[28]，說明HDJS2中必需氨基酸的含量遠高于冬蟲夏草。HDJS2和HDJS5-2還含有7 種藥用氨基酸（苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸），藥用氨基酸種類豐富，總相對含量分別為40.5%和27.5%，其中HDJS2藥用氨基酸總含量接近靈武長棗（藥用氨基酸占總氨基酸的42.1%）中藥用氨基酸的含量[29]，這說明HDJS2和HDJS5-2可能有一定的藥用價值。

機體細胞的癌變、衰老及其他疾病都與機體內(nèi)自由基的過量產(chǎn)生有直接的密切聯(lián)系[30-31]。霍山鐵皮石斛糖蛋白具有較強的還原能力和DPPH自由基清除能力[32]。本實驗測定了HDJS2和HDJS5-2的抗氧化活性。總還原能力、總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力均呈劑量依賴關(guān)系（圖5），抗氧化能力隨著糖蛋白質(zhì)量濃度的升高不斷增強。

脾細胞增殖是細胞免疫或體液免疫激活途徑中最重要的步驟之一，Zhang Wuxia等[33]研究發(fā)現(xiàn)從白芍中提取的多糖RPAPS能夠促進脾細胞增殖，Shen Zhuying等[34]發(fā)現(xiàn)納豆糖蛋白能夠顯著增強淋巴細胞的活化。HDJS2和HDJS5-2具有刺激免疫反應(yīng)的潛力。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物糖蛋白通過激活免疫細胞表面受體（Man受體、清道夫受體、Toll樣受體以及CD3/CD28等），促進下游通路產(chǎn)生細胞因子進行免疫調(diào)節(jié)[35-36]；T、B淋巴細胞表面抗原受體激活將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)，產(chǎn)生刺激淋巴細胞活化的信號，促進增殖。此外，Man和Fuc殘基，能夠與Man受體結(jié)合，激活免疫應(yīng)答反應(yīng)[37]。本實驗中的糖蛋白含有較多的Man和Fuc，分別占總糖相對含量的17%和50%，因此推測HDJS2和HDJS5-2可能通過激活抗原呈遞細胞Man受體及Toll樣受體等促進細胞因子的釋放，或者直接結(jié)合T、B細胞表面受體促進脾細胞增殖，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗為HDJS2和HDJS5-2的合理開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的參考。