麥胚清蛋白抗氧化肽的篩選及對細胞氧化損傷的保護作用

張 羽，汪 芳，翁澤斌，包伊凡，宋海昭,*，沈新春,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學中醫學院·中醫學院中西醫結合學院，江蘇 南京 210000）

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是機體代謝產生的一類氧化自由基，自由基過量或不足都會影響機體內環境的穩定。生物體內抗氧化防御系統主要由內源性抗氧化劑（谷胱甘肽（glutathione，GSH）等）和抗氧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化物酶等）組成，能夠維持機體正常的ROS代謝平衡，使ROS的產生和清除處于動態平衡，保護機體不受氧自由基的侵害[1]。當機體處于糖尿病和肥胖癥等代謝紊亂狀況下，無法清除自身的多余自由基，致使自由基過量累積，從而導致氧化應激。

大量研究表明，很多植物來源的天然化合物如多酚、多糖、肽等具有良好的抗氧化活性[2-4]，其中肽的抗氧化活性日益受到關注。抗氧化肽是一種具有抗氧化活性，能夠清除自由基，緩解氧化應激的生物活性肽。食源性抗氧化肽具有低毒高效的特點，可以廣泛應用于食品及保健品行業，具有廣闊的應用前景。動植物（如魚、牛奶、亞麻籽、苦蕎和小麥）來源的抗氧化肽已用于食品、藥品抗氧化劑的開發[5-9]。

小麥胚芽是小麥粉加工的副產物，含有質量分數約30%的麥胚蛋白，其中，麥胚清蛋白（wheat germ protease，WGA）的酶解產物由于具有較強的抗氧化性，其在功能食品開發領域研究較多。殷微微等[10]分析了麥胚蛋白酶解物清除自由基及抗脂質過氧化物的作用，發現了其在亞油酸體系中具有較強的抗氧化效果，是有效的天然抗氧化劑。張麗萍等[11]采用中性蛋白酶水解麥胚蛋白，發現水解物的抗氧化活性和蛋白本身的結構、肽鏈長短及氨基酸殘基有關。楊銘澤等[12]通過采用4 種不同蛋白酶對麥胚蛋白分別進行單酶水解、雙酶同步水解和分步水解，比較研究麥胚蛋白的酶解方法與水解物抗氧化功能的關系，發現堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解為最佳工藝。本課題組在之前的研究中通過響應面法優化WGA制備抗氧化肽條件，發現中性蛋白酶（底物質量分數為2.4%、加酶量5 900 U/g、酶解pH 7.04、酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h）為最佳用酶[13]。基于此，本研究以WGA中性蛋白酶酶解產物[13]為研究對象，通過超濾、凝交過濾層析、離子交換層析等技術對WGA酶解物（wheat germ protease hydrolysate，WGAH）進行逐級分離，根據各級分離產物的抗氧化活性篩選具有較高抗氧化活性的目標肽段，鑒定其氨基酸序列，并結合PeptideRanker數據庫活性預測結果篩選出抗氧化活性最高的肽序列，進一步采用高糖誘導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）及H2O2誘導的HepG2和VSMCs建立細胞氧化損傷模型，檢測其生物活性，旨在為麥胚抗氧化肽產品的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Sephadex G-75、Sephadex G-25、Sephadex C-25中國GE醫療集團；2,2-聯氮-雙(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、熒光素（fluorescein，FL）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride，AAPH）美國Sigma公司；HepG2細胞 南京中醫藥大學；VSMCs 北京市疾控中心；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM（dulbecco’s modified Eagle’s medium）培養基（低糖/高糖）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-胰蛋白酶（0.05%） 美國Gbico公司；小麥胚芽肽合成 金斯瑞生物工程有限公司；2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針、噻唑藍（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT） 美國Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Labscale小型切向流超濾系統 美國密理博公司；H1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀儀器有限公司；2XZ旋片真空泵 浙江黃巖天龍真空泵廠；蛋白質純化系統上海滬析分析儀器廠有限公司；MZE多功能酶標儀美國Molecular Devices公司；EksigentnanoLC-UltraTM2D納升液相色譜系統、TripleTOF 5600質譜系統 美國AB SCIEX公司；FACSVerse流式細胞儀 美國BD公司；熒光倒置顯微鏡 德國卡爾-蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 麥胚清蛋白酶解物制備和超濾膜分離

WGAH參考文獻[13]制備。用pH 7.4、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制質量分數為0.1%的WGAH，然后用0.45 μm纖維素膜過濾。選用截留分子質量分別為30 kDa和10 kDa的超濾膜，通過Labscale小型切向流超濾系統對酶解產物進行超濾分離，分離溫度為4 ℃，壓力小于0.1 MPa。將超濾得到的各級組分分別進行脫鹽后冷凍干燥。得到3 個組分：WGAH-I（＞30 kDa）、WGAH-II（10～30 kDa）和WGAH-III（＜10 kDa）。

1.3.2 葡聚糖凝交柱層析

用Sephadex G-75凝交柱（2.6 cm×70 cm）進行層析，將1.3.1節組分配制為質量分數2%的樣品溶液（去離子水溶解），上樣量為柱體積的5%，流速0.5 mL/min，溫度4 ℃，檢測220 nm波長處信號強度。去離子水洗脫，調節恒流泵。洗脫液收集速率為8 min/管。收集合并分離色譜圖中處于同一洗脫峰下的洗脫液并冷凍干燥，待測其抗氧化活性。

用Sephadex C-25陽離子交換柱（1.6 cm×60 cm）進行層析，加入含有0～2 mol/L NaCl的pH 4.0、0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液，以2 mL/min的流速進行洗脫，220 nm波長處檢測信號強度，洗脫液收集速率為2 min/管，收集合并分離色譜圖中處于同一洗脫峰下的洗脫液并冷凍干燥，待測其抗氧化活性。

用Sephadex G-25凝交柱（1.6 cm×60 cm）進行層析，用去離子水以0.5 mL/min的流速進行洗脫，220 nm波長處檢測信號強度，洗脫液收集速率為8 min/管，收集合并分離色譜圖中處于同一洗脫峰下的洗脫液并冷凍干燥，待測其抗氧化活性。

1.3.3 氧化自由基吸收能力測定

取20 μL質量濃度為50 μg/mL的1.3.2節逐級層析樣品或合成多肽溶液于96 孔熒光板中，加入80 μL 175 nmol/L的熒光素鈉溶液，37 ℃混勻，孵育15 min后加入100 μL 24 nmol/L AAPH反應，在激發與發射波長分別為485 nm和538 nm波長處連續測定熒光強度（1 次/2 min）。利用標準品繪制標準曲線，根據樣品測得的熒光強度計算氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）[14]，結果以Trolox的當量表示（μmol TE/g或μmol TE/μmol）。

1.3.4 ABTS陽離子自由基清除率測定

ABTS陽離子自由基清除率的測定參照Floch等[15]的方法。配制ABTS工作液，取96 孔板，每孔加入10 μL樣品溶液，190 μL的ABTS工作液，25 ℃避光反應20 min，測定734 nm波長處吸光度。按下式計算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A0表示對照組（樣品溶解液和ABTS）的吸光度；A表示實驗組的吸光度。

1.3.5 液相色譜-串聯質譜結構鑒定

采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對多肽樣品進行結構鑒定。結構鑒定由上海博苑生物科技有限公司完成。將凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中，分析柱采用ChromXP Eksigent C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm），流速0.4 mL/min，柱溫25 ℃，流動相A：2%（體積分數，后同）乙腈、0.1%甲酸；流動相B：98%乙腈、0.1%甲酸。梯度洗脫條件：流動相B由5%升高至35%（0～30 min）。采用TripleTOF 5600質譜系統結合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2.5 kV，霧化氣壓為5 psi，氣簾氣壓為30 psi，加熱器溫度為150 ℃，對Sephadex G-25凝交柱分離得到的抗氧化能力最佳的組分進行結構鑒定。數據采用Mascot 2.3軟件處理分析。

1.3.6 化學多肽合成

化學多肽委托金斯瑞生物科技公司用化學法固相合成（合成多肽純度＞95%）。

1.3.7 細胞培養

VSMCs培養：將細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養液中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，待細胞長至對數期用于實驗。

HepG2細胞培養：將細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養液中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，待細胞長至對數期用于實驗。

1.3.8 細胞氧化應激模型建立

高糖誘導的氧化應激模型：將VSMCs以1×105個/mL的濃度接種于96 孔板，于溫度37 ℃、CO2體積分數5%的培養箱中培養48 h后吸除培養液，加入不含血清的低糖DMEM培養液。16 h后，隨機分為3 組：正常組，不作任何處理；高糖組，加入適量質量分數45%的葡萄糖溶液，使其最終葡萄糖濃度為25 mmol/L；實驗組，加入最終濃度為25 mmol/L的葡萄糖和不同濃度（5、10、20、40 μmol/L）的抗氧化肽，培養 8 h后，使用MTT法[9]測定細胞存活率。

H2O2誘導的氧化應激模型：將HepG2細胞與VSMCs以1×105個/mL的濃度接種于96 孔板中，培養48 h后，每孔加入作用濃度為25、50、100、150、200 μmol/L的H2O2溶液，繼續培養12 h，除去培養液，使用MTT法測定細胞存活率，選取細胞存活率接近50%的H2O2濃度作為最適濃度，建立H2O2誘導的細胞氧化應激模型，在此基礎上加入不同濃度（5、10、20、40 μmol/L）的抗氧化肽，培養12 h后使用MTT法測細胞存活率。

1.3.9 活性氧水平的測定

將兩種細胞以1×105個/mL的濃度接種于6 孔板中，培養48 h后，按上述造模加樣的方法處理細胞后，吸除培養液，用pH 7.2、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3 次，加入0.8 mL濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液反應30 min，消化清洗細胞，制成細胞懸液，流式細胞儀檢測熒光強度，每次上樣1×104個細胞，用各處理組細胞與正常組細胞（未經高糖或H2O2誘導）熒光強度的比值表示活性氧水平。

1.4 數據統計與分析

所有實驗至少重復3 次，實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件進行t檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超濾法分離麥胚清蛋白酶解物

30 kDa和10 kDa兩種超濾膜將WGAH截留分成3 個組分：WGAH-I（分子質量＞30 kDa）、WGAH-II（分子質量為10～30 kDa）和WGAH-III（分子質量＜10 kDa）。ORAC法可以檢測物質抑制過氧化自由基誘發氧化反應的水平，能夠直接反映待測物質陰斷自由基鏈式反應的能力[16]；ABTS陽離子自由基的清除能力也常用作抗氧化活性評價指標。本研究應用ORAC法與ABTS法測定這3 個WGAH組分的體外抗氧化性。如表1所示，WGAH及其組分的分子質量和抗氧化活性具有顯著的負相關性。WGAH超濾得到的3 個組分的抗氧化活性隨著分子質量的減小而升高，其中WGAH-III組分抗氧化活性最高，其ORAC為1 258.98 μmol TE/g，ABTS陽離子自由基清除率為62.27%，分別為WGAH的1.14 倍和1.15 倍，是酶解前WGA的1.41 倍和2.68 倍（P＜0.05）。結果表明，WGAH分子質量越小，其抗氧化活性越高。有研究認為生物活性肽活性與分子質量的大小有關，例如Zhang Jixian[17]、Hu Fei[18]等在分別提取小麥胚芽肽和山核桃蛋白肽時均發現低分子質量肽具有較高的抗氧化活性。本實驗的結果與上述研究結果一致，并選擇WGAH-III（＜10 kDa）組分進行下一步層析分離。

表1 不同組分的ORAC與ABTS陽離子清除率Table 1 ORAC values and ABTS cation radical-scavenging activity of different separation fractions

2.2 WGAH-III組分的層析分離

葡聚糖凝交柱根據分子質量大小分離目標化合物，已被廣泛應用于分離蛋白質水解物中的肽段[19-20]。本研究采用交聯葡聚糖Sephadex G-75凝交柱分離WGAH-III組分，如圖1A1所示，可以看出WGAH-III組分經過Sephadex G-75分離后，得到5 個洗脫峰，分別為峰A、B、C、D、E。收集凍干后，分別測定5 個峰的ORAC，結果如圖1A2所示，C、D組分的ORAC最高且無顯著性差異。此外，ABTS陽離子自由基清除率結果顯示D組分的ABTS陽離子自由基清除率為81.04%，明顯高于C組分（71.85%）（數據未列出），因此本研究選擇D組分進行Sephadex C-25陽離子交換柱分離。

圖1 層析色譜圖以及不同組分的抗氧化活性Fig.1 Chromatogram and antioxidant activity of different separation fractions

離子交換色譜主要用于分離離子或可解離的化合物，因為它可以根據其對離子交換樹脂的親和力來分離帶電分子[21]。蛋白質水解物包含各種堿性或酸性氨基酸殘基的肽，這些肽易于吸附到固體載體（陽離子或陰離子交換樹脂）上，相互作用的強度取決于分子和官能團上的電荷的數量和位置[7,21]。如圖1B1所示，WGAH-III-D組分經過Sephadex C-25陽離子交換柱分離后，分離得到3 個峰，其中峰2的強度較高，分別對分離得到的3 個峰進行分段收集，脫鹽凍干后，進行ORAC抗氧化能力的測定，結果如圖1B2所示，峰2的ORAC抗氧化能力最高，峰3活性最低。該結果表明，經離子交換色譜分離，峰2具有最強的抗氧化能力。因此選擇峰2組分進行Sephadex G-25凝交柱分離。

Sephadex G-25凝交柱分離原理與Sephadex G-75凝交柱相同，根據分子質量不同分離目標化合物。Sephadex G-25凝交柱可分離的分子質量為1～5 kDa，如圖1C1所示，Sephadex G-25凝交柱對組分WGAH-III-D-2分離得到5 個峰，分別收集凍干后測定ORAC。如圖1C2所示，V組分的ORAC顯著高于其他4 個組分（P＜0.05），說明其抗氧化能力最強，這說明分子質量最小的V組分具有最高的抗氧化活性。因此，選取組分WGAH-III-D-2-V進行進一步研究。

2.3 凝交柱層析產物的結構鑒定與PeptideRanker數據庫預測

采用LC-MS/MS對WGAH-III-D-2-V組分進行結構鑒定，并通過Mascot 2.3軟件分析得到與小麥胚芽蛋白質組中同源性最高的20 個短肽。如表2所示，這些肽均由6～10 個氨基酸組成。大量研究證實這種由10 個以下氨基酸組成短肽的抗氧化活性要高于其母蛋白及多肽[22]，因為在蛋白質水解的過程中，肽鏈斷裂使具有高抗氧化活性的肽段暴露出來，有利于清除自由基、螯合過氧化金屬離子和抑制脂質過氧化[23]。本研究通過PeptideRanker數據庫對這20 種短肽進行活性預測分析。PeptideRanker是一個較為系統的肽數據庫，設置閾值為0.50，即預測值為0.50以上的肽被認為具有生物活性，且值越大生物活性越高。根據PeptideRanker數據庫活性預測結果，按其活性指數排序，并選取活性最高的8 種肽序列進行人工合成以進一步驗證其抗氧化活性。

表2 目標肽段的鑒定及生物活性的預測Table 2 Amino acid sequences of potent peptides identified by LC-MS/MS and biological activity of potent peptides predicted by PeptideRanker

2.4 活性肽的篩選

根據PeptideRanker數據庫活性預測結果選取活性最高的8 種肽序列，測定其ORAC及ABTS陽離子自由基清除能力。如表3所示，LNYPPY具有最高的ORAC（3.01 μmol TE/μmol）且清除ABTS陽離子自由基活性最強，清除率為95.58%。許多研究表明，肽的生物活性取決于氨基酸序列，氨基酸種類，以及分子質量。較小分子質量的肽具有較大的生物活性。多肽中氨基酸的特定位置影響其生物活性[24-25]，當多肽的末端含有疏水性（Leu、Val和Gly）和芳香族氨基酸（Phe和Tyr）時，具有較高的抗氧化活性[26]。肽序列中，疏水性氨基酸（Leu、Val和Gly）、親水性氨基酸（Pro）以及芳香族氨基酸（Phe和Tyr）的存在有助于其總體具有較高的抗氧化活性[27]。Fan Jian等[28]發現肽序列中含有Tyr有助于提高其抗氧化活性，與Tyr中含有酚羥基可以作為氫供體的特殊能力有關，特別是Tyr存在于肽末端。如表3所示，YDWPGGRN與LNYPPY都具有較高的自由基清除能力，推測與末端的Tyr有關，且LNYPPY含有兩個Tyr。其次，肽序列LNYPPY具有最強的抗氧化能力，與其N端具有較強疏水性和較低帶電性的Leu有關且其分子質量較小。因此，選取LNYPPY進行下一步研究，LNYPPY二級質譜圖如圖2所示。

表3 不同肽的ORAC與ABTS陽離子自由基清除率Table 3 ORAC and ABTS cation radical scavenging activity of different peptides

圖2 肽段LNYPPY的二級擬合質譜圖Fig.2 TOF-MS/MS spectrum of the peptide (LNYPPY）

2.5 LNYPPY對細胞氧化應激損傷作用的影響

許多研究表明，高糖環境會使平滑肌細胞內ROS的生成量增加，一方面高糖加劇了細胞內葡萄糖有氧氧化，超出了線粒體呼吸鏈的處理能力而發生單電子傳遞，使ROS產生量增加；另一方面高糖能夠激活細胞內NADPH氧化酶，使其表達量增加，導致ROS產生量增多，所以高糖誘導的VSMCs氧化應激模型被廣泛用于體外抗氧化活性研究[29-30]。如圖3所示，高糖能誘導VSMCs ROS水平極顯著上升并使細胞異常增殖（P＜0.01），抗氧化肽LNYPPY的添加并沒有顯著抑制高糖誘導的VSMCs的異常增殖和ROS產生，說明LNYPPY對高糖誘導的VSMCs氧化應激損傷無保護作用。

圖3 LNYPPY對高糖誘導的VSMCs增殖及ROS水平的影響Fig.3 Effect of LNYPPY on viability and ROS levels of VSMCs exposed to high glucose

除了高糖誘導的VSMCs氧化應激模型，H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激模型也經常用來檢測抗氧化肽的生物活性。H2O2是一種常見的氧自由基產生物，在機體中容易分解產生羥自由基或氧自由基導致細胞過氧化損傷。已有研究表明不同濃度的H2O2會引起HepG2細胞不同程度的氧化損傷[31]。因此，本研究選用H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激模型來檢測LNYPPY的生物活性。

建立體外氧化應激模型的關鍵是確定適宜的H2O2氧化損傷誘導濃度，本研究選取不同濃度的H2O2（濃度梯度為25、50、100、150、200 μmol/L）對HepG2細胞進行誘導損傷，如圖4A所示，加入H2O2處理12 h后，H2O2對HepG2細胞存活率的影響呈現明顯的劑量依賴效應。當50 μmol/L H2O2刺激HepG2細胞時，可極顯著抑制HepG2細胞的增殖（P＜0.01），當H2O2濃度為150 μmol/L時，HepG2細胞存活率降至50%，因此選擇添加150 μmol/L H2O2的HepG2為細胞氧化損傷模型。如圖4B所示，在150 μmol/L H2O2誘導處理的HepG2細胞中添加抗氧化肽LNYPPY共同培養后，隨著抗氧化肽濃度的增加（5、10、20、40 μmol/L），細胞存活率隨之提高，且抗氧化肽處理組（10、20、40 μmol/L）與模型組相比具有極顯著性差異（P＜0.01），說明抗氧化肽LNYPPY能夠有效改善由H2O2誘導HepG2細胞的活力降低。如圖4C所示，當H2O2濃度為150 μmol/L時，HepG2細胞ROS水平是正常細胞的3.26 倍，加入抗氧化肽LNYPPY后，隨著肽濃度的增加（5、10、20、40 μmol/L），ROS水平極顯著下降（P＜0.01），當肽濃度為40 μmol/L時，該條件下ROS水平降至正常細胞的1.47 倍。說明抗氧化肽LNYPPY能夠有效的減少由外源性H2O2引起的HepG2細胞ROS異常增多的現象，對HepG2細胞氧化損傷具有保護作用，從而維護細胞的代謝平衡。

圖4 LNYPPY對H2O2誘導的細胞存活率及ROS水平的影響Fig.4 Effect of LNYPPY on viability and ROS levels of cells exposed to H2O2

本研究還探討了LNYPPY對H2O2誘導的VSMCs氧化損傷的作用。當H2O2濃度為200 μmol/L時可使VSMCs存活率降低幅度大于30%，因此選擇200 μmol/L H2O2為建立模型的最適劑量，結果顯示加入不同濃度的LNYPPY能夠顯著改善由H2O2誘導的VSMCs活性降低的現象（圖4D、E）。該結果進一步說明抗氧化肽LNYPPY對H2O2誘導的VSMCs氧化應激損傷具有很好的保護作用。

氧化應激參與許多慢性疾病，如酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化、動脈粥樣硬化等的發生過程，研究氧化應激模型對于篩選抗氧化藥物以及功能食品的開發具有重要意義[32]。肝臟及肌肉是體內能量代謝的重要場所，也是慢性疾病發生的主要部位，肝細胞與肌細胞也經常用作體外生物活性研究。因此本實驗選用了兩種常用細胞（HepG2細胞和VSMCs）來建立氧化應激模型研究抗氧化肽LNYPPY的體外抗氧化活性。研究結果顯示抗氧化肽LNYPPY對于H2O2誘導的HepG2和VSMCs氧化應激損傷具有很好的保護作用，說明抗氧化肽LNYPPY在生物體內也具有很好的清除氧化自由基的功能，可作為抗氧化劑進行開發應用。

高糖誘導的氧化應激是通過刺激細胞產生內源性ROS，造成細胞代謝紊亂，而H2O2對細胞造成氧化損傷的原理主要是通過外源刺激細胞產生過量的ROS，從而破壞細胞代謝平衡，造成細胞存活率降低。本研究發現抗氧化肽LNYPPY對高糖誘導的VSMCs氧化應激無作用，而對H2O2誘導的HepG2細胞和VSMCs氧化應激損傷有保護作用，可能與其在細胞中的作用靶點及其相對應的作用機制有關。有研究表明肽ADWGGPLPH能夠通過作用于PKC/AMPK/NOX4信號通路，從而改善高糖誘導的VSMCs氧化應激損傷[30]，而H2O2是通過Nrf2/HO-1通路誘導氧化應激損傷[33-34]。Yao Yijun等[35]通過研究發現薏仁種子不溶性多酚提取物可以通過Nrf2信號通路改善H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激損傷；Chen Lei等[36]發現覆盆子提取物可以通過Nrf2信號通路對HepG2細胞氧化損傷產生保護作用。根據本研究結果推測肽LNYPPY在細胞內可能作用于Nrf2/HO-1信號通路，而對PKC/AMPK/NOX4信號通路無明顯影響。關于抗氧化肽LNYPPY改善H2O2誘導的氧化損傷分子機制還需要進一步研究。

3 結 論

本研究利用超濾、Sephadex G-75凝交柱分離層析、Sephadex C-25陽離子交換層析和Sephadex G-25凝交柱層析以及PeptideRanker數據庫活性預測技術從WGAH中分離篩選得到了具有較高抗氧化活性的肽LNYPPY，并進一步通過高糖誘導VSMCs以及H2O2誘導HepG2細胞和VSMCs建立細胞氧化應激模型，發現LNYPPY對高糖誘導的VSMCs氧化應激損傷無明顯改善作用，但對H2O2誘導的HepG2細胞和VSMCs氧化應激損傷具有很好的保護作用，且根據這一結果推測LNYPPY的抗氧化作用可能是通過Nrf2/HO-1信號通路的介導。本研究可為麥胚蛋白抗氧化肽的理論研究與開發應用提供重要參考。