慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者應用痰真菌涂片與痰真菌免疫熒光染色檢測法進行快速診斷的價值比較

劉鴻宇 周峻林

上海市東方醫院吉安醫院呼吸科，江西吉安 343000

慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是由于患者肺部炎癥反應造成呼吸道粘液分泌增多后容易堵塞結構相對狹窄的支氣管腔，從而造成氣流阻塞。本病多為感染所致，尤其是免疫功能低下、體質較差的老年患者[1]。本病的早期診斷對及時預防惡性并發癥具有重要作用。過去，病人的痰液常被采集作真菌培養，作為診斷呼吸道感染的金標準。陽性標本中可觀察到真菌孢子、菌絲、孢子囊等，但該方法耗時長，不便于大樣本的篩選。雖然采用直接涂片顯微鏡檢查比較方便，但陽性率較低，因此仍需尋找一種更方便有效的檢測手段[2]。

真菌免疫熒光染色法是一種快速檢測真菌的方法，適用于臨床檢測各種疑似真菌感染的熒光染料和活檢標本或體液（黏液、肺泡灌洗液等）中可能含有β-的真菌細胞壁多糖，進行熒光標記后，在熒光檢測顯微鏡下，可以快速定性檢測人體組織和體液中可能存在的各種真菌（霉菌和酵母菌），能夠初步判定真菌感染，檢測精度和速度比傳統真菌有了很大提高[3-5]。基于此，本研究選取上海市東方醫院吉安醫院送檢的60 例AECOPD 患者的痰液標本作為研究對象，旨在比較痰真菌涂片與痰真菌免疫熒光染色檢測法用于AECOPD 患者的快速診斷的價值，以推廣優勢方法用于AECOPD 患者真菌感染的早期診斷及治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2020年6月于上海市東方醫院吉安醫院送檢的60 例AECOPD 患者的痰液標本作為研究對象。其中男31 例，女29 例；年齡20～82歲；來自呼吸科病房34 例，ICU 病房26 例。本研究經過醫院醫學倫理委員會審核批準，患者均自愿參與研究并簽署知情同意書。

納入標準：①符合世界中醫藥學會聯合會《國際中醫臨床實踐指南慢性阻塞性肺疾病》 中慢性阻塞性肺疾病急性加重期的診斷標準[1]；②影像學上出現了新的肺部浸潤影；③持續發熱≥96 h，經過積極抗菌治療后無效。排除標準：①入院1 周內已接受過抗真菌治療；②接受過血液透析治療。

1.2 方法

及時將痰標本送檢痰真菌涂片、痰免疫熒光染色、痰真菌培養等檢查。

1.2.1 標本取材 入院后應立即取痰標本。建議在清晨取痰標本。患者早晨起床后應清潔口腔3 次。清潔后，用力咳嗽，將深呼吸道的痰咳入無菌容器，然后密封送至實驗室。對于人工氣道患者，醫務人員應在氣道插管下用集痰器收集深呼吸道分泌物，并嚴格執行無菌操作。

1.2.2 痰真菌涂片 將送檢標本先進行涂片，按規范步驟進行革蘭染色，鏡下觀察10 個視野，若發現真菌，需詳細記錄菌體、可疑性病原菌、球囊的情況。

1.2.3 痰真菌培養對已涂布觀察的標本進行真菌培養，培養基材料包括哥倫比亞血瓊脂、萬古霉素巧克力瓊脂、沙氏葡萄瓊脂以及念珠菌顯色平板，置于35℃，5%CO2培養箱中培養，5 d 后若無真菌生長則為陰性。

1.2.4 痰真菌免疫熒光檢測 ①檢測原理：真菌免疫熒光顯色試劑購自濟南德亨醫學科技有限公司（魯濟械備20180127 號）。該試劑盒可根據免疫學和熒光顯色原理快速檢測各種樣品中的β 葡聚糖或幾丁質成分。根據其形態特征，對標記物進行了鑒定和分析。真菌細胞壁富含葡聚糖、幾丁質等多糖，因此更容易被標記，通過熒光顯微鏡紫外光（波長：340～380 nm）激發靶點上的熒光素發光，鏡下可觀察其形態，從而定性檢測真菌。②具體步驟：挑取樣本制成涂片，干燥后充分固定;或者將組織切片按常規脫蠟至水。將標本放于水平位置，加一滴顯色試劑覆蓋于標本上，蓋上蓋玻片，使其與標本充分結合。染色維持2 min，濾紙吸收多余染料，熒光顯微鏡下觀察（波長：340～380 nm）。真菌菌絲體和孢子呈亮藍色，結構清晰。但真菌感染的診斷應以臨床經驗為依據判斷。③注意事項：a.壓片后，用濾紙吸去多余染液，這樣可使鏡下效果更清晰，同時避免液體溢出造成污染[6]。b.染色后盡快閱片，以免液體干涸影響觀察。c.在暗室環境中使用波長范圍: 340～380 nm 的熒光濾板閱片，否則會造成假陰性結果[7]。d.試劑貯存時，盡量避免高、低溫環境及陽光直射。e.每次試劑使用后，請迅速蓋好密封保存，以免揮發及影響效果。

1.3 觀察指標及評價標準

比較兩種方法在痰真菌培養陽性結果中痰真菌涂片陽性率和真菌免疫熒光檢測的陽性率。以痰真菌培養結果為金標準，靈敏度=真陽性例數/（真陽性+假陰性）例數×100%；特異度=真陰性例數/（假陽性+真陰性）例數×100%；準確度=（真陽性+真陰性）例數/總例數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析。計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰真菌涂片及痰真菌免疫熒光檢測結果

痰真菌涂片檢出真陽性患者30 例，真陰性患者12 例；痰真菌免疫熒光檢測檢出真陽性患者39 例，真陰性患者16 例（表1）。

表1 痰真菌涂片及痰真菌免疫熒光檢測結果（例）

2.2 兩種檢測方法靈敏度、特異度、準確度的比較

痰真菌免疫熒光檢測結果靈敏度為92.86%，高于痰真菌涂片的71.42%，差異有統計學意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結果特異度為88.89%，高于痰真菌涂片的66.67%，差異有統計學意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結果準確度為93.33%，高于痰真菌涂片的70.00%，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

表2 兩種檢測方法靈敏度、特異度、準確度的比較[%（n/N）]

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是一種常見的疾病，其特征是持續的呼吸系統癥狀和氣流受限，通常是由氣道或肺泡異常引起的。2012年，約有300 萬人死于慢性阻塞性肺疾病，占全球死亡人數的6%；2013年，中國約有91 萬人死于慢性阻塞性肺疾病，占全球死亡總數的31.1%[8]。目前，慢性阻塞性肺病是全球第四大疾病死亡原因，預計到2020年將升至第三位[8]。在AECOPD患者中，感染是其發生的重要原因，近年來真菌感染的發病率逐漸上升，是導致AECOPD 惡化的誘因之一。肺部真菌感染的臨床表現缺乏特異性，易導致肺部感染的早期診斷和治療[9]。以往痰涂片革蘭氏染色法以其操作簡單、觀察方便等優點被廣泛應用于實驗室，但其陽性檢出率明顯低于培養法[10]。痰標本真菌培養也是目前臨床微生物學檢查中最好的診斷方法，培養后，顯微鏡下可見真菌孢子、菌絲、顆粒和孢囊等，但培養時間長，標本不合格或培養不規范，會降低結果的準確性[11]。因此，痰涂片和痰培養需要進一步的研究和分析。

真菌免疫熒光染色法是一種新型的真菌檢測方法，操作簡便、快速、準確，可檢測各種真菌樣品[12]。該技術能快速、定性地檢測人體組織或標本中可能存在的各種真菌，通過抗體特異性結合和形態學觀察，確保真菌檢測結果的高陽性率和高準確率，從而提高臨床治愈率。真菌熒光染色用于苯乙烯類化合物，是一種新型非特異性熒光染料，通過特殊的熒光標記結合幾丁質酶與真菌細胞壁上的幾丁質結合產生特異性，在熒光顯微鏡下觀察，菌絲和孢子在特定波長下發出明亮的藍色熒光，而其他成分均為淡灰藍色，能快速檢測出真菌，適用于各種疑似真菌感染的檢查，熒光染色法能快速高效地發現真菌菌絲和孢子，且結構清晰，提高真菌檢測率[13]。本研究通過比較痰一般細菌涂片法及痰真菌免疫熒光檢測法的陽性率占真菌培養陽性結果中的比例，從而分析出上述兩種痰真菌檢測方法的優勢，以便指導臨床快速診斷ACEOPD 患者真菌感染。本研究結果顯示，痰真菌免疫熒光檢測結果靈敏度為92.86%，高于痰真菌涂片的71.42%，差異有統計學意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結果特異度為88.89%，高于痰真菌涂片的66.67%，差異有統計學意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結果準確度為93.33%，高于痰真菌涂片的70.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。提示痰真菌免疫熒光檢測適合推廣用于AECOPD 患者真菌感染快速診斷，能夠快速指導臨床抗真菌藥物的使用，從而對減少AECOPD 的治療負擔有重要意義[14-15]。

綜上所述，真菌免疫熒光法與痰真菌涂片相比具有更高的靈敏度、特異度和準確度，可減少假陰性的發生，降低漏檢率，值得推廣應用。