瑞舒伐他汀對載脂蛋白E基因敲除動脈粥樣硬化小鼠的作用研究

吳 妍 韓 銓 胡 柳 王昱植 付國峰 郭 璐

浙江養生堂天然藥物研究所有限公司，浙江杭州 310024

動脈粥樣硬化屬于心腦血管疾病范疇，涵蓋冠心病的根本病理基礎，是冠心病的主要潛在病因，包括脂質代謝失調以及涉及單核細胞與功能紊亂的內皮細胞結合[1]。動脈粥樣硬化的發生發展是一個長期且十分復雜的病理過程，近幾十年來，已有多種假說解釋動脈粥樣硬化的發病機制，包括氧化應激學說、機械損傷學說、炎癥學說等[1]，但目前為止以上所有學說均不能很好全面地解釋動脈粥樣硬化發生與發展的全過程。由于動脈粥樣硬化發病機制的復雜性以及其具有動態變化的特性，給動脈粥樣硬化的治療帶來了一定的困難。近年來，中醫中藥的療效優勢逐漸受到重視，但中藥復方的作用靶點仍不甚明了。目前他汀類藥物是臨床應用最為廣泛的調脂藥物[2]。本研究在既往研究的基礎上，以載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE-/-）基因敲除動脈粥樣硬化小鼠為研究對象，觀察瑞舒伐他汀調控血脂及相關炎癥指標和抗動脈粥樣硬化斑塊形成的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 ApoE-/-小鼠，6 周齡，共20 只。同齡的具有相同遺傳背景的C57BL/6/J 小鼠10 只。所有動物均在浙江省醫學科學院實驗動物中心飼養，SPF 級，自由飲水及攝食。實驗動物購自南京集萃藥康生物有限公司，合格證號：SCXK（蘇）20180008。本實驗已經過相關動物倫理委員會審核同意。

1.1.2 藥物及試劑 瑞舒伐他汀片[商品名：可定；規格：10 mg/片（按照人體最大劑量換算）；批號：S01102；阿斯利康藥業（中國）有限公司]。蘇丹Ⅳ染色劑（Sigma，貨號：198102）、無水乙醇、二甲苯購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。

1.1.3 儀器 LWC400 全自動血生化分析儀（深圳藍韻醫療科技有限公司）；OLYMPUS-SZ61 體式顯微鏡（Olympus optical 公司）；Kylin-bell TS-2 數顯搖床；西門子Sequoia512 彩色多普勒超聲診斷儀。

1.2 分組、造模及給藥

所有ApoE-/-小鼠6 周齡起全程給予高脂飼料。20 只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組和瑞舒伐他汀組，每組各10 只。另10 只C57BL/6J 小鼠作為正常組予以普通飼料。正常組：給予等體積水灌胃并同時給予普通飼料；模型組：給予等體積水灌胃并同時給予高脂飼料；瑞舒伐他汀組：按瑞舒伐他汀片10 mg/kg劑量灌胃給藥并同時給予高脂飼料。所有小鼠均于16 周齡起給予藥物或水灌胃，灌胃時間為每天上午10 點，每天灌胃1 次，共計4 周，給藥并觀察至20 周齡末取材。

1.3 取材

每組小鼠于20 周齡末摘眼球取血并分離血清，檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。分離主動脈予以甲醛固定，一半進行動脈粥樣硬化斑塊染色，一半進行斑塊穩定性及血管硬化程度分析。

1.4 檢測指標

1.4.1 血脂檢測 各組小鼠分別摘眼球，內眥取血，離心分離血清，檢測TC、TG、LDL。

1.4.2 血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 變化檢測 按照試劑盒說明書進行檢測。

1.4.3 主動脈病理形態學觀察 取主動脈，甲醛固定，并采用蘇丹Ⅳ染色劑進行染色，使用Image J 進行斑塊面積分析。

1.4.4 動脈超聲檢測 所有小鼠在處死之前1 d 禁食超過8 h，檢查前剔除腹部體毛，應用西門子Sequoia512彩色多普勒超聲診斷儀，14 MHz 高頻線陣探頭分別測量肝后段主動脈中膜厚度3 次，取平均值。同時測量同一位置主動脈最大血流速度3 次（θ 角=60°），取平均值。

1.4.5 動脈粥樣硬化斑塊穩定性分析 使用Movat5 色套染法和HE 染色，利用圖像分析軟件測量并計算胞外脂質、泡沫細胞、膠原以及平滑肌各自占斑塊面積的比例，根據計算公式：斑塊易損指數=（胞外脂質成分+泡沫細胞）/（平滑肌細胞+膠原成分）綜合評估瑞舒伐他汀對小鼠主動脈斑塊穩定性的影響。

1.4.6 動脈粥樣硬化血管硬化程度分析 取小鼠主動脈弓血管，包埋、切片后使用Von Kossa 染色法，在光鏡下觀測主動脈鈣鹽沉積情況。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瑞舒伐他汀對小鼠血脂水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠的血清TC、TG、LDL水平均升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，瑞舒伐他汀組小鼠的血清TG 水平下降，差異有統計學意義（P<0.01）；瑞舒伐他汀組小鼠的血清LDL、TC 水平與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖1）。

2.2 瑞舒伐他汀對小鼠炎癥指標的影響

與正常組比較，模型組小鼠的血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平均升高，差異有統計學意義（P<0.01）；瑞舒伐他汀組小鼠的血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

圖2 各組實驗小鼠血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平的比較（mmol/L，±s，n=10）

2.3 瑞舒伐他汀對斑塊面積的影響

模型組小鼠的主動脈斑塊沉積面積平均值達39.66%，瑞舒伐他汀組小鼠的主動脈斑塊沉積面積平均值達25.87%；瑞舒伐他汀組與模型組小鼠的主動脈斑塊沉積面積比較，差異有統計學意義（P<0.01）（圖3，封三）。

圖3 瑞舒伐他汀對斑塊面積的影響（n=6）

2.4 瑞舒伐他汀對主動脈中膜厚度的影響

主動脈超聲結果顯示，各組小鼠的主動脈中膜厚度比較，差異無統計學意義（F=0.8965，P=0.4302）（圖4）。

圖4 各組實驗小鼠主動脈中膜厚度的比較（±s，n=5）

2.5 瑞舒伐他汀對斑塊穩定性的影響

與模型組比較，瑞舒伐他汀組的斑塊易損指數降低，差異有統計學意義（P<0.01）（圖5，封三）。

圖5 瑞舒伐他汀對斑塊穩定性的影響（n=5）

2.6 瑞舒伐他汀對血管鈣化程度的影響

與模型組比較，瑞舒伐他汀組的血管鈣化面積降低，差異有統計學意義（P<0.01）（圖6，封三）。

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病的主要潛在病因，是脂質代謝失調以及涉及單核細胞與功能紊亂的內皮細胞結合，包括其募集到動脈壁易感區以及分化為巨噬細胞并發育成泡沫細胞的炎癥過程的綜合結果[1，3]。泡沫細胞的積累使動脈內膜出現脂肪條紋，進而隨著疾病的發展，泡沫細胞逐漸積累，導致形成動脈粥樣硬化斑塊[1，4]。他汀類藥物是臨床驗證有效的膽固醇合成抑制劑。他汀類藥物在降低血脂以及冠心病的一、二級預防中的作用已在多項大規模臨床試驗一致地被證實[2]。然而，相關研究表明，他汀類藥物的作用可能遠不止其降低血脂水平的作用[5-6]。他汀類藥物可能通過與血脂降低依賴無關的機制防止動脈粥樣硬化來保護心血管系統。瑞舒伐他汀已顯示出幾項有益的特征，包括半衰期長、安全性良好以及較低可能與細胞色素P450 發生藥物相互作用等[7]。本研究利用ApoE-/-小鼠，探索瑞舒伐他汀在動脈粥樣硬化形成后的作用效果以及在斑塊穩定性和血管鈣化方向的改善情況。

引起動脈粥樣硬化過程最廣泛使用的動物模型是ApoE-/-小鼠[8]。ApoE-/-小鼠在正常的飲食條件下會發展為明顯的高膽固醇血癥，到3 個月大時會在主動脈竇和主動脈近端形成富含泡沫細胞的脂肪病變[9-10]，并在8～9 個月后出現纖維性病變[9，11-12]。這些小鼠的動脈粥樣硬化病變具有人類和其他物種所特有的特征[9，11，13]，它們含有氧化特異性表位[14]，并且黏附分子VCAM-1 和ICAM-1 以及TF 的表達在該小鼠品系中被上調[15-16]。ApoE-/-小鼠對類似人的西方飲食（富含膽固醇）和藥理治療敏感[17-18]。

本研究發現瑞舒伐他汀在高膽固醇血癥ApoE-/-小鼠中具有抗動脈粥樣硬化的特性，除了降低血清TG 外，并沒有降低膽固醇和降低炎癥的作用。實際上，在實驗條件下，瑞舒伐他汀治療既不影響血漿脂質（TC），也不影響治療期間膽固醇的總體暴露。Sparrow 等[19]也觀察到類似的結果。據報道，他汀類藥物在降低野生型和ApoE-/-小鼠的膽固醇水平方面均無效，這可能是由于缺乏LDL 受體（ApoE 的配體之一），或由于在該種小鼠體內發生的HMG-CoA 還原酶補體代償性增加所致[19-21]。瑞舒伐他汀不具有很強的降膽固醇活性，這使得能夠評估其抗炎和抗血栓形成作用，并獨立于藥物的降膽固醇特性來考慮它們。在ApoE-/-小鼠內皮中易發生動脈粥樣硬化的部位，VCAM-1 和ICAM-1 的表達會上調，這一數據與相關報道[15]的研究結果一致。Kleeman 等[22]研究表明，瑞舒伐他汀可以降低血管壁中促動脈粥樣硬化性細胞因子（如MCP-1 和TNF-α）的表達。但在本項研究中并未得到相似結果。

血管內膜-中膜厚度是指內膜回聲至中膜-外膜回聲之間的垂直距離，超聲測試模式測量動物血管厚度大大提高了測量血管厚度的方便性和準確性，而這一技術也在各種研究中逐漸普及[23]。本研究結果顯示，瑞舒伐他汀組的斑塊易損指數低于模型組（P<0.01），并且可以評估不同主動脈段的斑塊穩定性情況。血管鈣化是指發生于血管軟組織內的不適當的鈣化，是動脈粥樣硬化后期的病理表現，表現為血管壁僵硬性增加，順應性降低，易引發血栓形成，斑塊破裂，是心腦血管疾病高發病率和高死亡率的重要原因。本研究發現ApoE-/-模型組小鼠主動脈弓部位的血管有較多的鈣鹽沉積，即血管發生較為嚴重的硬化，瑞舒伐他汀組未有鈣鹽沉積。并且可以考慮不同主動脈段的血管硬化情況。

綜上所述，瑞舒伐他汀可通過非降脂途徑降低ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化程度，并可改善斑塊的易損性以及血管鈣化程度。