Ael04亞型的鑒定與輸血策略研究*

張?jiān)葡?楊曉俊 姚曉麓 陳發(fā)文, 彭迎霞 謝海花

1 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院輸血科，福建省福州市 350001；2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院輸血科； 3 福建省立金山醫(yī)院檢驗(yàn)科

正確鑒定ABO血型對(duì)臨床輸血至關(guān)重要。ABO亞型是引起ABO血型鑒定正反定不符或凝集強(qiáng)度減弱的常見(jiàn)原因之一。ABO亞型個(gè)體血型極易誤判，且需要制定特殊的安全輸血策略。我們?cè)诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)了2例正反定不符的樣本，血清學(xué)鑒定結(jié)果符合Ael亞型特征，進(jìn)一步通過(guò)ABO基因檢測(cè)證實(shí)為Ael04亞型，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 先證者1:女，28歲，漢族，福建泉州，孕婦，無(wú)輸血史，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院東海院區(qū)送檢；先證者2:女，47歲，漢族，福建寧德，宮頸癌患者，無(wú)輸血史。兩人術(shù)前備血時(shí)，血型鑒定困難。在遵循知情同意原則下，采集先證者及其家系成員血液及唾液標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2 試劑和儀器 單克隆抗-A、抗-B、抗-H、抗-A1植物凝集素、A1/B/O標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(上海血液生物)、A2紅細(xì)胞(美國(guó)Immucor)、單克隆抗-AB(法國(guó)Diagast)、血型鑒定卡(西班牙戴安娜)、人源抗-A由本實(shí)驗(yàn)室自制(A型新生兒溶血病患兒母親血清，含高效價(jià)IgG抗-A,不含冷凝集素和不規(guī)則抗體)，DNA提取試劑盒(北京天根)，BASO 2005-2型醫(yī)用低速離心機(jī)(珠海貝索)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 試驗(yàn)操作 血型正反定型 、吸收放散試驗(yàn)、唾液血型物質(zhì)測(cè)定均嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》和相應(yīng)試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行[1]。

1.4 α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GTA)活性的測(cè)定[2](1)隨機(jī)挑選3人份O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞混合，取生理鹽水3洗后的壓積紅細(xì)胞40μl，加入400μl反應(yīng)液中[pH=6.5的0.05mol/L 咪唑緩沖液、質(zhì)量濃度0.5%的牛血清白蛋白、0.025mol/L MnCl2、0.15mol/L NaCl、0.5mmol/L UDP-GalNAc 各40μl；待檢血漿200μl]；在37℃恒溫循環(huán)解凍箱中擺動(dòng)水浴4h后，再用生理鹽水洗滌3次，制得5%濃度的指示紅細(xì)胞懸液待用。(2)將單克隆抗-A和抗-B進(jìn)行倍比稀釋(1∶1～1∶256)后待用。(3)取50μl 5%濃度的指示紅細(xì)胞懸液，與50μl不同稀釋度的抗-A、抗-B混合后，置室溫中反應(yīng)20min，110g 離心30s，通過(guò)肉眼和顯微鏡觀察凝集強(qiáng)度。血漿酶活性強(qiáng)度以發(fā)生凝集的抗體最高滴度來(lái)表示，并分別選取3人份A型(O型)獻(xiàn)血者的混合血漿作為陽(yáng)性(陰性)對(duì)照。

1.5 ABO基因直接測(cè)序 嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書提取血液基因組DNA，使用天津秀鵬提供的特異性引物對(duì)ABO基因第1～7外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，由天津秀鵬進(jìn)行雙向測(cè)序，采用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定基因突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 先證者1、先證者2及其兄長(zhǎng)紅細(xì)胞與抗-A、抗-B、抗-A,B、抗-A1均無(wú)凝集，與抗-H強(qiáng)凝集(3+～4+)，正定型為O型；3人血清與A1細(xì)胞呈弱凝集(±～1+)，與B細(xì)胞呈強(qiáng)凝集(2+S～4+)，A、B細(xì)胞凝集強(qiáng)度差2+以上，同時(shí)與A2細(xì)胞無(wú)凝集，說(shuō)明血清中存在抗-A1,而非抗-A。吸收放散試驗(yàn)可檢出紅細(xì)胞表面弱A抗原的存在，唾液中僅檢出H物質(zhì)。推測(cè)3人均為A亞，疑似Ael表型。先證者1父親紅細(xì)胞與抗-A、抗-A1均無(wú)凝集，與抗-B均呈4+強(qiáng)度的凝集，正定型為B型；血清與A1c反應(yīng)呈弱凝集(±～1+)，與A2細(xì)胞無(wú)凝集，說(shuō)明血清中存在抗-A1。唾液中僅檢出H物質(zhì)。推測(cè)先證者1父親為A亞型B，疑似AelB表型。見(jiàn)表1。

表1 2名先證者的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 A糖基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)結(jié)果 先證者1及其父、先證者2及其兄長(zhǎng)和陰性對(duì)照均未檢出A酶活性，陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為1∶64。

2.3 ABO基因直接測(cè)序結(jié)果 直接測(cè)序分析結(jié)果顯示，先證者1和2 存在261delG 、內(nèi)含子6+5G>A、467C>T的雜合突變，以A101為參考序列，其中261delG為O01等位基因的特征性突變，467C>T 為A102等位基因的特征性突變，內(nèi)含子6+5G>A為Ael04等位基因的特征性突變,綜合分析，先證者1和2的A基因在A102等位基因的基礎(chǔ)上發(fā)生了內(nèi)含子6+5G>A的突變，根據(jù)紅細(xì)胞血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，將其基因型定為Ael04/O01。先證者1父親存在297A>G、526C>G、657C>G、703G>A、796C>A、803G>C和930G>A的雜合突變，此為B101等位基因的特征性突變。此外還存在467C>T 和內(nèi)含子6+5G>A的雜合突變，先證者1父親的A基因在A102等位基因的基礎(chǔ)上發(fā)生了內(nèi)含子6+5G>A的突變，基因型為Ael04/B101。見(jiàn)圖1。

圖1 ABO基因直接測(cè)序結(jié)果

3 討論

ABO血型亞型由ABO基因變異形成，其抗原分子結(jié)構(gòu)與ABO血型抗原存在一定差異。A抗原是由A基因編碼產(chǎn)生的N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶，將N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移到H物質(zhì)的巖藻糖花半乳糖殘基而形成。 A亞型是在等位基因上發(fā)生核苷酸序列改變，進(jìn)而引起糖基轉(zhuǎn)移酶活性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞表面表達(dá)的A抗原質(zhì)量或數(shù)量發(fā)生改變，最終引起血型血清學(xué)正反定型不符。

Ael亞型是種較為罕見(jiàn)的 ABO 亞型，Ael 血型亞型在我國(guó)人群表達(dá)概率約為1/8萬(wàn)[3]。Ael亞型的血清學(xué)特征是紅細(xì)胞與抗-A、抗-A,B無(wú)凝集，血清中常存在不規(guī)則抗-A1，但通常效價(jià)不高。分泌型者唾液中未檢出A物質(zhì)，體外試驗(yàn)血漿中無(wú)法檢出A酶活性，僅可通過(guò)吸收放散試驗(yàn)證實(shí)紅細(xì)胞表面A抗原的存在。Ael/O基因型個(gè)體正定型類O，反定型A1細(xì)胞弱凝集，B細(xì)胞強(qiáng)凝集，凝集差多在2+以上，很可能被誤判為O型。Ael/B基因型個(gè)體,正定型表現(xiàn)為B型，反定型B細(xì)胞無(wú)凝集，A1細(xì)胞弱凝集。Ael/B基因型個(gè)體血清學(xué)上與B1型個(gè)體抗-A減弱較難區(qū)分。其中B1型抗-A減弱個(gè)體，球蛋白多偏低，反定型與新鮮的A2細(xì)胞凝集。

ABO亞型的形成主要與ABO基因外顯子的突變密切相關(guān)，此外還與ABO基因內(nèi)含子、啟動(dòng)子等區(qū)域的突變有關(guān)[4]。目前已知的ABO亞型中涉及內(nèi)含子突變的主要有Aw15(IVS6+4A>T)、Aw28(IVS1+2T>C)、Aw44(IVS6+4A>G)、Aw45(IVS4+1delG)、Ael04(IVS6+5G>A)、A308(IVS2+3A>G)、B303(IVS3+5G>A)、Bel08(IVS1+5G>C)。Ael04亞型第6內(nèi)含子的第5個(gè)堿基由鳥(niǎo)苷酸替換為腺苷酸。臺(tái)灣學(xué)者Chen 等[5]通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)IVS6+5G>A 突變導(dǎo)致Ael04亞型存在至少10種異常的剪接轉(zhuǎn)錄本。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致了早期終止，并在翻譯過(guò)程中產(chǎn)生非功能蛋白。其中沒(méi)有外顯子5-6的轉(zhuǎn)錄本被預(yù)測(cè)可以產(chǎn)生n端缺失57個(gè)氨基酸的功能性Ael糖基轉(zhuǎn)移酶,導(dǎo)致紅細(xì)胞表面A抗原的弱表達(dá)。本研究通過(guò)3種不同的在線剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具亦得出ABO基因內(nèi)含子6+5G>A突變會(huì)對(duì)供者剪接位點(diǎn)造成影響。

像本研究中的Ael/O和Ael/B基因型個(gè)體，血型極易誤判為O型和B型，輸血時(shí)需制定特殊的輸血策略。當(dāng)他們作為供者，將其紅細(xì)胞輸注給O型和B型受血者，由于受血者血漿中存在大量的抗-A，會(huì)與Ael亞型供者紅細(xì)胞表面的弱A抗原結(jié)合，有可能發(fā)生較嚴(yán)重的溶血反應(yīng)[6]，如若作為獻(xiàn)血員，可以將Ael 血型定型為A型，絕不能定型為O型；Ael/B獻(xiàn)血員可以定型為AB型。Ael/O和Ael/B基因型個(gè)體作為受血者時(shí)，若輸注了O型和B型懸浮紅細(xì)胞，懸浮紅細(xì)胞中僅含少量的血漿(少量抗-A)，不會(huì)對(duì)患者健康造成嚴(yán)重影響。但為安全起見(jiàn)，緊急情況下推薦輸注O型和B型洗滌紅細(xì)胞[7]。輸血漿時(shí)，若輸注大量O型和B型血漿(如血漿置換時(shí))，仍有發(fā)生較嚴(yán)重溶血反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，故應(yīng)輸注A型和AB型血漿和血小板類制品[8-9]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在遇到ABO亞型時(shí)可通過(guò)基因檢測(cè)手段協(xié)助鑒定血型，為安全輸血提供保障。