miR-146b在急性Stanford A型主動脈夾層組織中的表達水平研究

陳小玲 賴木勝

1 中國醫學科學院阜外醫院深圳醫院,廣東省深圳市 518057； 2 深圳市福田區慢性病防治院

主動脈夾層是一種常見的急性心臟大血管疾病，臨床發病率在0.03%，病情兇險、病死率高[1]。該病是因主動脈壁的中層強度顯著降低，在高速血流作用下，使主動脈內膜被撕裂并形成破口，此時血液流入破口，血管結構被剝離，血腫不斷蔓延，并在內膜、中外膜間隙形成一層假腔[2-3]。急性Stanford A型主動脈夾層發病急、進展快，若未有效處理，其病死率超過80%[4]。當前急性Stanford A型主動脈夾層影像學檢查較為容易，但其具體發病機制仍有諸多爭議，而內皮細胞損傷、編碼肌動肌球蛋白特異性基因突變極有可能是疾病發病機制的關鍵。MicroRNAs(miRNAs)屬于非編碼小RNA，對大部分編碼蛋白質mRNA轉錄過程的調節，促使RNA沉默，多個報道表明miRAN參與了機體內諸多生理及病理過程[5-7]。miR-146b在心臟內有較高的含量，在心肌病變損害時升高明顯，而在主動脈夾層病變組織內的表達是否有不同仍需探討。因此本研究特建立急性Stanford A型主動脈夾層動物模型，分析miR-146b的表達水平，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD大鼠15只，3周齡，單獨飼養，正常飲食、飲水，廣州中醫藥大學提供，飼養條件SPF級；體質量54～68g，平均體質量(60.05±1.14)g；按實驗動物要求，專人對動物進行飼養，對其建立急性Stanford A型主動脈夾層動物模型。

1.2 儀器設備 手術器械由上海金鐘醫療器械公司提供，JP2000-09心電監護儀由科力威公司提供；Newport HT70型呼吸機由柯惠醫療公司提供，6-0 Prolene線由美國強生公司提供。

1.3 方法 實驗大鼠于胸部正中做切口，心包懸吊，顯露升主動脈，分離升動脈壁中層間隙，形成假腔。切開內層中膜、內膜，連接主動脈腔，人工滌綸血管縫合，于切口遠端升主動脈的中膜及內膜進行折疊，縫合到側壁，使血液進入假腔。升主動脈切口縫合，側壁鉗縫合后，加強縫合切口。制作夾層，并向遠端發展，關閉切口，完成模型建立。建模后，觸診受鼠心跳，心跳持續超過72h，即為手術成功。模型建立完成后，符合《主動脈疾病診斷和治療指南》[8]中急性Stanford A型主動脈夾層標準。所有實驗大鼠在實驗結束后，處死，切除全部主動脈，觀察夾層撕裂組織。采集外周血5ml，抗凝，室溫靜置60min，離心20min，3 000r/min，采集血清，置入無酶離心管，-80℃環境內保存。術中切除主動脈時，采集0.5cm×0.5cm×0.5cm主動脈壁組織，以中性福爾馬林固定，-80℃環境內保存。取血清250μl，轉移至新的無酶離心管內，置入濃度為20nmol/L的cel-miR-39 10μl，混勻。美國Ambion公司生產的TRIzol試劑盒及配套試劑，按照說明書操作提取血清miRNA及主動脈壁組織內的miRNA，用Thermo-Fisher公司生產的核酸紫外線分析儀檢測RNA濃度。德國Eppendorf公司生產的PCR擴增儀測定miR-146b的表達水平，反應體系20μl，95℃變性10min，95℃ 5s，退火60℃ 50s，循環40個。比較不同風險程度急性Stanford A型主動脈夾層的血清、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平。

1.4 評價標準 Stanford A型主動脈夾層風險評估，按照主動脈夾層嚴重程度臨床評分賦值表評價[9]，涉及突發性撕裂胸痛(有=5分，無=0分)、夾層累及度(0～3分)、重要臟器缺血程度(意識障礙=5分，腹痛、少尿=5分)，心功能分級Ⅲ～Ⅳ級(Ⅲ級=3分，Ⅳ級=5分)，冠狀動脈受累(0、3分)，主動脈竇受累(0、2分)，主動脈瓣關閉不全(2～4分)，心包或胸腔積液(3～5分)、夾層瘤體最大徑(3～5分)、休克(有=5分，無=0分)，高血壓(有=1分，無=0分)，左室舒張末徑(0、1分)，D-二聚體(0～1分)，雙上肢收縮壓差20mmHg(1mmHg=0.133kPa)以上或雙下肢收縮壓差10mmHg以上(有=4分，無=0分)，輕度：<20分；中度：20～30分；重度：>30分。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件處理數據。三組數據采用重復方差F檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性Stanford A型主動脈夾層建立 急性Stanford A型主動脈夾層模型成功建立，肉眼見主動脈形成夾層明顯，主動脈中膜撕裂，見夾層撕裂內膜片、真假腔形成。

2.2 疾病不同風險程度血清、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平比較 中度、重度風險動物模型血清、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平高于輕度風險，重度風險高于中度風險，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 疾病不同風險程度血清、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平比較(2-△△Ct)

2.3 相關性分析 相關性分析顯示，急性Stanford A型主動脈夾層大鼠外周血、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平與疾病風險程度呈正相關性(r=0.861，0.894，P<0.05)。

3 討論

主動脈夾層起病危急，是臨床較為常見的心臟大血管疾病。若病變累及升主動脈，其破裂風險明顯增加，病情危重、致死率極高，搶救成功率明顯降低。一般根據夾層是否累及升主動脈，將其分為Stanford A型與B型主動脈夾層，前者起病突然、進展快速，及早診斷、明確發病機制，是降低疾病病死率的關鍵[10]。目前對急性Stanford A型主動脈夾層的發病機制認識仍未明確，其中miRNAs是否與疾病的形成相關，受到臨床重視。miRNAs是一類單鏈非編碼小分子RNA，長19～23個堿基，通過結合mRNA3’非編碼區，調整與基因表達相關的單核苷酸序列[11]。miR-146b是處于基因間的miRNA，保守性高，通過配對靶mRNA不完全堿基，對靶基因翻譯過程的抑制，影響疾病病理變化過程。通常心臟內有較高水平的miR-146b，陳其敬等[12]表明急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿內miR-146b表達水平升高，可作為本病診斷及治療的新靶點。動物實驗[13]表明體內轉染miR-146能增加膿毒癥小鼠臟器組織miR-146b水平，抑制炎性因子釋放，減輕臟器損傷。而miR-146表達在急性Stanford A型主動脈夾層中的意義卻缺乏相關報道。侯維納等[14]研究發現miR-146b表達升高與心肌損傷相關，測定其水平變化，有助于判斷病毒性心肌炎的病情及預后。本組研究中，急性Stanford A型主動脈夾層大鼠模型成功建立，肉眼見主動脈形成夾層明顯，主動脈中膜撕裂，中度、重度風險大鼠血清、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平均高于輕度風險，重度風險高于中度風險(P<0.05)。相關性分析，急性Stanford A型主動脈夾層動物外周血、主動脈夾層組織內miR-146b的表達水平與疾病風險程度呈正相關性。結果表明病情越嚴重，血清及夾層組織內的miR-146b表達水平越高，有望成為疾病風險及預后評估的重要指標。但關于miR-146b在疾病發生、發展中的作用機制尚未明確，可能是miR-146b通過NFKB1、MMP16、TRAF6等靶基因，作用于疾病發生。其中NFKB1是一種特異性核蛋白，該蛋白過度激活，或促使動脈粥樣硬化、免疫性炎癥反應等血管疾病的發生，參與了炎癥機制、免疫應答等多種病理變化過程，而炎癥反應可能是主動脈夾層發生的重

要原因[15]。MMP16通過活化細胞外特異性MMP2，使MMP1與TIMP-1之間的平衡性被破壞，導致主動脈壁組織內膠原彈性纖維被降解，中層囊性壞死，以此形成Stanford A型主動脈夾層。

綜上所述，動物模型的建立可為主動脈夾層治療、預后判斷提供穩定可靠的研究模型。急性Stanford A型主動脈夾層動物大鼠的外周血以及主動脈壁組織內miR-146b表達水平呈顯著增加趨勢，與主動脈夾層風險、病情程度呈正相關性，病情越嚴重，miR-146b表達水平越高，有望成為疾病診斷、預后評估的新型分子標志物。