CC類趨化因子配體2對結核分枝桿菌感染人單核巨噬細胞THP-1自噬的影響及分子機制

李秀萍，王 玲，王 馨，嚴曉蕓，董 力

結核病是一種嚴重的傳染病，由結核分枝桿菌感染引起，對人類健康構成了巨大威脅。有流行病學統計數據顯示，近年來我國結核病病例顯著增加[1]。有研究表明，結核分枝桿菌是一種細胞內病原體，可寄生于宿主巨噬細胞，通過調控炎癥反應及吞噬體酸化、成熟等不同機制調節宿主細胞死亡[2]。巨噬細胞能夠殺滅微生物，但結核分枝桿菌仍然能夠克服巨噬細胞的殺微生物機制而存活并復制[3]。自噬促進受損細胞器和錯誤折疊蛋白質降解，在抗菌防御機制中起著關鍵作用。重要的是，自噬既可以調節宿主對分枝桿菌感染的抗性，又可以控制細胞的存活[4]。CC類趨化因子配體2(CCL2)是一種調節單核細胞和巨噬細胞向感染部位遷移和滲透的關鍵趨化因子，其水平與結核病嚴重程度相關[5]。有研究顯示，CD44能夠促進結核分枝桿菌感染巨噬細胞中CCL2的表達[6]。還有研究表明，CCL2參與調節角質形成細胞的自噬[7]。然而，現臨床尚未確定CCL2對結核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬的影響。因此，本研究探討CCL2對結核分枝桿菌感染人單核巨噬細胞THP-1自噬的影響及分子機制，以期為結核病的防治提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑 結核分枝桿菌H37Rv株和人單核巨噬細胞THP-1(美國ATCC)；RPMI 1640培養基和青-鏈霉素雙抗(美國HyClone)；胎牛血清(美國Gibco)；Lipofectmine 2000轉染試劑(美國Invitrogen)；TRIzol試劑(北京索萊寶)；PrimeScript RT試劑盒和Green Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa)；CCL2 siRNA和siRNA control(廣州銳博生物)；CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗(美國CST)；RIPA裂解液(上海碧云天)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發光試劑盒(賽默飛世爾)。

1.2細胞培養 THP-1細胞復蘇后在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液加1%青-鏈霉素雙抗中進行培養，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱進行培養，觀察細胞生長狀態并及時更換培養液，采用胰蛋白酶消化細胞并傳代處理，選取生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.3H37Rv感染THP-1細胞 將傳代的THP-1細胞接種到6孔板中，接種密度為1×106/ml，向每孔中加入濃度為150 ng/ml的佛波酯(PMA)(美國Sigma公司)溶液，37 ℃培養箱誘導培養24 h，去上清，PBS沖洗3次，再向每孔中添加2 ml無血清無雙抗的培養液，將H37Rv以MOI=5感染細胞[8]，37 ℃培養箱感染4 h，棄上清，更換成新的培養液，此時記為感染0 h，測定CCL2 mRNA和蛋白表達，隨后分別在感染6、12、24和48 h時測定CCL2 mRNA和蛋白表達。

1.4細胞轉染和分組處理 待THP-1細胞貼壁良好，根據Lipofectmine 2000轉染試劑使用說明書分別將CCL2 siRNA或siRNA control轉染至THP-1細胞，轉染6 h后更換完全培養液，實驗分為Mock(對照)組、H37Rv(感染)組、H37Rv+si-NC(降低CCL2感染對照)組和H37Rv+si-CCL2(降低CCL2感染)組，其中H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組的THP-1細胞于轉染48 h后，將H37Rv以MOI=5進行感染，并在H37Rv+si-CCL2組中添加濃度為150 ng/ml的NF-κB信號通路激活劑PMA進行干預作為H37Rv+si-CCL2+PMA組，24 h后分別收集各組細胞進行相關指標的檢測。

1.5RT-PCR檢測CCL2 mRNA表達量 使用TRIzol試劑分離待測各組THP-1細胞中總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒對RNA進行逆轉錄，按照使用說明書采用Green Premix Ex Taq Ⅱ進行RT-PCR檢測。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt分析CCL2 mRNA表達量。GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。CCL2上游引物：5'-GCTCCGGGCCCAGTATCT-3'，下游引物：5' -ACAGGGAAGGTGAAGGGTATGA-3' 。

1.6Western blot檢測CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α蛋白表達量 將待測THP-1細胞在裂解緩沖液中裂解以提取總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質濃度，隨后將蛋白質用15%SDS-PAGE分離，然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與一抗(CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α均為1∶1000稀釋)在4 ℃下孵育過夜，然后將膜與二抗(1∶3000稀釋)一起孵育2 h。使用ECL化學發光試劑盒顯影，采集圖像獲得條帶，以GAPDH進行標定，使用Image J軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.7菌落形成單位計數分析H37Rv胞內存活率 將降低CCL2表達的THP-1細胞以2×105/孔接種到6孔板中，貼壁后將H37Rv以MOI=5進行感染，6 h后棄上清，PBS沖洗3次，加入含20 μg/ml阿米卡星(山東齊魯制藥有限公司)的培養液，殺死未進入細胞的H37Rv，在第4天以0.1%的Triton X-100裂解細胞，以10倍梯度稀釋，涂布在7H11平板中，在37 ℃培養箱培養3周，進行菌落計數分析H37Rv胞內存活率。

2 結果

2.1H37Rv感染THP-1細胞中CCL2表達 H37Rv感染THP-1細胞不同時間CCL2 mRNA和CCL2蛋白總體比較差異有統計學意義(P<0.01)。H37Rv感染THP-1細胞6 h CCL2 mRNA和CCL2蛋白開始逐漸升高，隨著感染時間延長CCL2 mRNA和CCL2蛋白持續升高，于24 h達到最高水平，48 h又有所降低。H37Rv感染THP-1細胞不同時間CCL2 mRNA和CCL2蛋白兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1和圖1。后續實驗選擇感染時間為24 h。

表1 不同時間H37Rv感染THP-1細胞中CCL2表達比較

圖1 不同時間H37Rv感染THP-1細胞中CCL2蛋白表達

2.2CCL2在H37Rv感染THP-1細胞中轉染效率 Mock組、H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組4組H37Rv感染THP-1細胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表達總體比較差異有統計學意義(P<0.01)。與Mock組比較，H37Rv感染THP-1細胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表達H37Rv組和H37Rv+si-NC組均升高；與H37Rv組和H37Rv+si-NC組比較，H37Rv感染THP-1細胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表達H37Rv+si-CCL2組降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2和圖2。

表2 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中CCL2表達比較

圖2 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中CCL2蛋白表達

2.3CCL2降低對H37Rv感染THP-1細胞自噬影響 Mock組、H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組4組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達總體比較差異有統計學意義(P<0.01)。與Mock組比較，H37Rv組和H37Rv+si-NC組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ和p62表達升高，LC3-Ⅱ表達降低；與H37Rv組和H37Rv+si-NC組比較，H37Rv+si-CCL2組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ和p62表達降低，LC3-Ⅱ表達升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表3和圖3。

圖3 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達比較

表3 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達比較

2.4CCL2降低對H37Rv胞內存活影響 H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組H37Rv胞內存活率分別為(100.00±9.22)%、(98.57±9.14)%和(46.88±4.52)%。3組H37Rv胞內存活率總體比較差異有統計學意義(P<0.01)。H37Rv組和H37Rv+si-NC組H37Rv胞內存活率明顯高于H37Rv+si-CCL2組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.5CCL2對H37Rv感染THP-1細胞中NF-κB信號通路激活影響 Mock組、H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組4組H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達總體比較差異有統計學意義(P<0.01)。與Mock組比較，H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達H37Rv組和H37Rv+si-NC組均升高；與H37Rv組和H37Rv+si-NC組比較，H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達H37Rv+si-CCL2組降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表4和圖4。

圖4 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達

表4 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達比較

2.6PMA逆轉CCL2降低對H37Rv感染THP-1細胞自噬影響 與H37Rv+si-CCL2組比較，H37Rv+si-CCL2+PMA組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ和p62表達升高，LC3-Ⅱ表達降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5和圖5。

圖5 H37Rv+si-CCL2組和H37Rv+si-CCL2+PMA組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達

表5 H37Rv+si-CCL2組和H37Rv+si-CCL2+PMA組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達比較

3 討論

結核分枝桿菌感染肺部時，將導致結核病的發生，結核病是一種高病死率的傳染病[9]。到目前為止，尚沒有有效疫苗可以預防所有的結核分枝桿菌菌株，當前結核病的藥物治療面臨耐藥性的障礙，故現迫切需要弄清結核分枝桿菌感染的病理機制，以便可以確定有效的治療靶標和診斷生物標志物[10]。在體內，結核分枝桿菌具有較長的潛伏期，這給結核病診斷和治療帶來了挑戰，而及時的診斷和治療對遏制結核病的傳播具有重要意義。越來越多的研究表明，結核分枝桿菌可以改變基因表達，從而導致免疫逃逸[11-12]。以往研究發現，CCL2在肺結核患者中異常表達，提示它可能在肺結核發生和發展中起關鍵作用[13]。本研究結果發現，H37Rv感染THP-1細胞能夠升高CCL2的表達，降低CCL2的表達可通過阻斷NF-κB信號通路抑制H37Rv感染THP-1細胞自噬。

人體防御機制是病原體入侵研究必不可少的內容。自噬是許多類型病原體感染的關鍵防御機制[14]。自噬是維持細胞穩態的重要生理過程，可促進細胞存活，為抵抗微生物入侵的重要防御機制。然而，在分枝桿菌感染中，分枝桿菌利用自噬以確保其細胞內存活[15-16]。因此，在分枝桿菌感染中發現自噬過程背后的主要調節劑具有重要意義。本研究探討CCL2對結核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬的影響。首先，本研究評估了CCL2和結核分枝桿菌之間的關系，觀察到結核分枝桿菌以時間依賴的方式升高CCL2的表達水平。接著，本研究確認由結核分枝桿菌改變的防御機制是否與CCL2的異常表達有關。然后，本研究探討CCL2表達降低對巨噬細胞自噬及結核分枝桿菌存活的影響。值得注意的是，本研究發現CCL2表達降低增強了正常巨噬細胞自噬，并抑制結核分枝桿菌的存活。這一發現證實了結核分枝桿菌對細胞自噬的影響是通過CCL2表達降低實現的，這表明CCL2可能為肺結核提供了新的治療靶點。以往研究顯示，在結核病患者中NF-κB信號通路異常活化，且結核分枝桿菌感染后能夠激活NF-κB信號通路[17-18]。有研究顯示，大豆凝集素誘導的自噬通過產生活性氧并通過NF-κB信號通路發揮抗結核分枝桿菌的作用[19]。本研究結果同樣發現，結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中NF-κB信號通路關鍵蛋白p65、IKK-α和IκB-α表達升高，而降低CCL2能夠有效抑制p65、IKK-α和IκB-α的表達。此外，NF-κB信號通路激活劑PMA能夠逆轉CCL2降低對結核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬的抑制作用。以上結果表明CCL2可能通過抑制NF-κB信號通路調節結核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬。

綜上所述，結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中CCL2表達升高，降低CCL2能夠激活自噬并抑制結核分枝桿菌胞內存活，其作用機制與抑制NF-κB信號通路有關。CCL2似乎是結核分枝桿菌感染巨噬細胞中宿主防御機制的一部分，本研究結果有助于進一步了解細胞內穩態在防御細菌感染中的調控機制，為結核病的治療提供實驗基礎。