miR-30-5p和SOCS1在食管癌組織中的表達及臨床意義

黃 義，顏 彥，黃友軍

食管癌是癌癥相關死亡的重要原因之一，近年來食管癌發病率呈逐漸升高趨勢，嚴重威脅人類健康[1]。種族因素、遺傳因素和生活方式等在食管鱗狀細胞癌的發生和發展中起重要作用。深入研究食管癌的發病原因和機制，早期診斷和治療，對于延長食管癌患者生存時間意義重大。微小RNA(miRNA)是非編碼、進化保守的短RNA，通過結合mRNA的3＇ 非翻譯區(3＇ UTR)調控基因mRNA的穩定性調節基因表達，不僅可維持細胞正常生物學過程，還在腫瘤和炎癥等疾病病理過程中發揮重要的作用[2]。miR-30-5p屬于miR-30家族成員，有研究顯示miR-30-5p在結直腸癌和胃癌等腫瘤中表達升高，促進轉化生長因子-β1誘導的上皮間質轉化，發揮促癌的生物學作用[3-4]。細胞因子信號傳導抑制因子1(SOCS1)的編碼基因位于人類16號染色體短臂，編碼蛋白可以抑制細胞因子信號傳導因子的生物學功能。有研究表明，SOCS1在人類肝細胞肝癌和卵巢癌等腫瘤中表達下降，誘導STAT3-Mcl1軸過度激活，促進腫瘤惡性進展[5-6]。Lin等[7]學者發現，SOCS1是miR-30家族的重要下游靶基因，miR-30家族成員能夠抑制IFN/JAK/STAT信號通路的傳導，導致病毒感染過程中的免疫逃逸。miR-30-5p和SOCS1在食管癌中的表達及相互關系現尚不清楚。本研究通過檢測miR-30-5p和SOCS1在食管癌中的表達，初步探討其臨床意義,現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月—2017年1月郴州市第一人民醫院收治的符合納入及排除標準接受手術治療的食管癌85例作為研究對象。85例中男52例，女33例；年齡(53.4±6.2)歲；病程(3.5±1.2)個月;腫瘤位置：上胸段18例，中胸段40例，下胸段27例；腫瘤直徑:≤5 cm 39例，>5 cm 46例；病理分級：高分化22例，中分化28例，低分化35例；腫瘤分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期40例，Ⅲ期18例；淋巴結轉移：有37例，無48例。本研究符合“赫爾辛基宣言”，經醫院醫學倫理委員會批準同意執行。自出院之日起對入選患者進行隨訪，以電話方式隨訪，每月1次，隨訪3年，隨訪截至2020年1月，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結束。

1.2納入及排除標準 納入標準：①初次就診，無外院診治史；②術前無放化療等治療史；③經病理檢查明確診斷為食管癌；④無食管狹窄和反流性食管炎等食管良性疾??；⑤患者和(或)其家屬對本研究知情同意并簽署相關知情同意書。排除標準：①合并胃腸炎和腸結核等急性感染性疾病患者；②伴心肺功能衰竭患者；③伴免疫缺陷性疾病和精神障礙等患者。

1.3qRT-PCR檢測組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達 取食管癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上)，液氮中研磨，Trizol法提取RNA，分光光度計檢測RNA的濃度及純度，OD 260/OD 280介于1.8～2.1。以RNA為模板進行逆轉錄，合成cDNA。以cDNA為模板，進行qRT-PCR。總體系20 μl，包括SYBR Green 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，雙蒸水6 μl。miR-30-5p上游引物：5＇-AGTTGGACGAAGCAAATCCTC-3＇，下游引物：5＇-AGGTCGTGAGAGTAGCGACA-3＇;內參U6上游引物:5＇-TTCGGCAGCACATATACTAAAATTGG-3＇，下游引物:3＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5＇；SOCS1 mRNA上游引物:5＇-CATTCAGACGGAGCGTGCTTAC-3＇，下游引物:5＇-TGCATCTTCATCTTCGTCAC-3＇；內參GAPDH上游引物:5＇-AGCCGACCGGTTCTGTCAT-3＇，下游引物:3＇-GGTCATAACCTGGTTCATCATCAC-5＇。miR-30-5p反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環。SOCS1 mRNA反應條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 25 s，70 ℃ 30 s，共40個循環。miR-30-5p和SOCS1 mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt值表示。以miR-30-5p和SOCS1 mRNA相對表達量的平均數1.850和0.875為界，分別將其分為高表達患者和低表達患者[5]。

1.4免疫印跡法檢測組織中SOCS1蛋白表達 將食管癌組織和癌旁組織剪碎后勻漿器勻漿，離心去沉淀，取上清加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解10 min。取上清BCA定量，加入SDS緩沖液，95 ℃金屬浴10 min。后進行聚丙烯凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒流300 mA轉印90 min。5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。SOCS1一抗(1∶1000，購自Abcam公司，貨號：ab9870)4 ℃過夜；二抗(1∶5000)中孵育，室溫1 h。電化學發光法顯影照相，出現灰色條帶則判定為蛋白陽性表達。

1.5觀察指標 比較食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表達，分析食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達與食管癌患者臨床病理特征關系，探討食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達的相關性，預測食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA的結合位點，分析食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表達與食管癌患者預后關系。

2 結果

2.1食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表達 食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p的相對表達量分別為1.850±0.432和0.612±0.117，SOCS1 mRNA的相對表達量分別為0.875±0.120和2.143±0.635。食管癌組織中miR-30-5p相對表達量高于癌旁組織，而SOCS1 mRNA相對表達量低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1a。食管癌組織和癌旁組織中SOCS1蛋白表達陽性率分別為12.9%(11/85)、94.1%(80/85)，SOCS1蛋白表達陽性率食管癌組織低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。SOCS1蛋白免疫印跡條帶見圖1b。

圖1 食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表達

2.2食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達與食管癌患者臨床病理特征關系 食管癌患者不同病理分級、腫瘤分期和有無淋巴結轉移食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；而食管癌患者不同性別、年齡、病程、腫瘤位置和腫瘤直徑食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達與食管癌患者臨床病理特征關系

2.3食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達相關性及結合位點預測 Pearson相關性分析結果顯示，食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達呈明顯負相關(r=-0.547,P<0.001)，見圖2a。Target Scan Human 7.2生物信息軟件預測食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA結合位點結果顯示，SOCS1 mRNA序列3＇ UTR的285～292堿基位置處含有與miR-30-5p互補結合位點，見圖2b。

圖2 食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達相關性及結合位點預測

2.4食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表達與食管癌患者預后關系 食管癌85例中無失訪病例，隨訪3～36(27.1±6.2)個月，隨訪期間死亡53例，3年總體生存率為37.6%(32/85)。3年總體生存率食管癌組織中miR-30-5p高表達患者和低表達患者分別為19.0%(8/42)和55.8%(24/43)，SOCS1 mRNA高表達患者和低表達患者分別為56.1%(23/41)和20.5%(9/44)。Kaplan-meier生存分析結果顯示，3年總體生存率食管癌組織中miR-30-5p高表達患者低于低表達患者，SOCS1 mRNA高表達患者高于低表達患者，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3a和3b。

圖3 食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表達與食管癌患者預后關系

3 討論

食管癌是起源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，我國每年食管癌新發病例約26萬例，死亡病例約19萬例，嚴重威脅人們身體健康[8]。食管癌早期常無明顯臨床表現，發現時多已處于中晚期，喪失手術治療最佳時機，導致預后不良。食管癌的發生與多種因素有關，遺傳因素和環境因素等共同作用促進食管癌的發生和發展[9]。探討食管癌發病原因及機制，對食管癌的預防和臨床新藥研發等具有重要臨床意義。

近年來，分子生物學研究不斷發展，特別是分子靶向藥物及免疫檢查點藥物等的臨床應用為腫瘤治療帶來新的希望。細胞內的miRNA是調節細胞生物學行為的重要分子，長度19～23個核苷酸，成熟的miRNA與Dicer等構成RNA誘導的沉默復合物，結合并抑制靶基因mRNA的表達，調控細胞增殖、分化及衰老等生理病理過程[10-11]。有研究表明，腫瘤組織中多種miRNA表達異常，并影響腫瘤細胞的增殖和遷移等生物學行為，與腫瘤惡性進展密切相關[12]。miR-30-5p位于人類6號染色體，在多種人類腫瘤中異常表達，通過影響下游轉錄因子Snail下游信號通路的傳導，發揮促進腫瘤發生和發展的生物學作用[13]。本研究結果顯示，食管癌組織中miR-30-5p相對表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義。miR-30-5p表達升高的具體機制現尚不清楚。Huang等[14]報道，miR-30-5p受到核因子κB(NF-κB)正調控作用的影響，腫瘤發生時NF-κB信號通路激活促進miR-30-5p表達升高。本研究結果還顯示，食管癌患者不同病理分級、腫瘤分期和有無淋巴結轉移食管癌組織miR-30-5p表達差異有統計學意義。表明食管癌組織miR-30-5p表達水平升高促進食管癌惡性進展。有研究報道，miR-30-5p表達升高能夠直接激活Wnt信號通路的信號傳導，促進腫瘤上皮間質轉化過程，導致腫瘤細胞遷移和侵襲能力增強，造成腫瘤易發生淋巴結轉移，病理分級和腫瘤分期增加[15]。

SOCS1屬于細胞因子信號傳導抑制因子家族的成員，其編碼蛋白能夠負性調控JAK/STAT信號通路[16-17]。SOCS1具有進化保守的Src同源域2結構域，是結合JAK并發揮負性調控功能的主要結構域[18-19]。有研究表明，SOCS1作為一種抑癌基因，在磷酸化激活后能夠以二聚體的形式發揮生物活性功能，抑制腫瘤的進展[20]。本研究結果顯示，食管癌組織中SOCS1 mRNA相對表達量低于癌旁組織，差異有統計學意義，分析其機制可能與轉錄后調控異常有關。Zhang等[21]研究表明，miR-155等非編碼RNA能夠與SOCS1 mRNA 3＇ UTR結合，并降解SOCS1 mRNA抑制SOCS1蛋白表達。本研究結果顯示，食管癌患者不同病理分級、腫瘤分期和有無淋巴結轉移食管癌組織SOCS1 mRNA表達差異有統計學意義。分析其機制可能是SOCS1 mRNA低表達導致與p53相互作用減弱，抑制p53抑癌基因功能，進而促進腫瘤G2/M期轉換，加快腫瘤細胞增殖及轉移等行為[22]。本研究Kaplan-meier生存分析結果顯示，3年總體生存率食管癌組織中miR-30-5p高表達患者低于低表達患者，SOCS1 mRNA高表達患者高于低表達患者，差異有統計學意義。表明食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達水平對食管癌患者預后具有一定預測價值。有研究報道，miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達水平能夠影響順鉑類抗癌藥物治療的敏感性，體外細胞實驗證實二者能夠逆轉化療藥物耐藥性形成[23-24]。此外，本研究結果還顯示，食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達呈明顯負相關，SOCS1 mRNA序列3＇ UTR的285～292堿基位置處含有與miR-30-5p互補結合位點，提示SOCS1 mRNA可能受到miR-30-5p的靶向調控。Lin等[7]研究證實，miR-30家族能夠抑制SOCS1的表達，進而促進下游IFN/JAK/STAT信號的傳導。

綜上所述，食管癌組織中miR-30-5p表達升高，而SOCS1 mRNA和蛋白表達降低，其與食管癌患者病理分級、腫瘤分期、有無淋巴結轉移及預后有關，共同促進食管癌惡性進展。miR-30-5p和SOCS1有望作為評估食管癌患者預后的腫瘤標志物，但二者在食管癌中的相互作用機制及臨床應用有待深入研究。