MLH1和CK20在結直腸癌前病變與結直腸癌中的表達及臨床意義

周德祥

天津市濱海新區中醫醫院(天津中醫藥大學第四附屬醫院)病理科 (天津 300451)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的一種惡性腫瘤，近年來發現其發病率和死亡率均出現上升趨勢[1-2]。2018年流行病學數據顯示，歐洲新發結直腸癌病例約為38.8萬例，結直腸癌相關死亡病例約為17.4萬例，而我國每年約有超過25萬例新增病例和14萬例結直腸癌相關死亡病例[3]。2019年，我國國家癌癥中心公布的全國癌癥統計數據顯示，在所有惡性腫瘤里，CRC的發病率排列在第3位，死亡率排列在第5位，嚴重危害著公眾的生命健康[4]。

目前，結直腸癌的發生主要以正常黏膜-息肉-腺瘤伴癌前病變-癌變演變進程為主，這種演變主要分為增生性息肉(hyperplastic poly，HP)、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤(sessile serrate adenoma/poly，SSA/P)、傳統鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)和鋸齒狀腺癌(serrated adenocarcinoma，SA)[5]。其中，無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤可能通過鋸齒狀通路發生癌變，這種癌變與錯配修復基因(MMR)缺陷導致的微衛星不穩定(MSI)有較大的相關性。微衛星不穩定主要與MMR蛋白表達異常相關，研究顯示錯配修復蛋白MLH1是結直腸癌發生的主要相關蛋白，如果表達異常會使得結直腸癌的患病概率大大提高[6]。

此外，細胞角蛋白20(CK20)是一種中間絲蛋白，其表達具有嚴格的上皮組織特異性，可能與淋巴結轉移和腫瘤浸潤程度有一定的關系，有研究者提出CK20可作為檢測結直腸癌的一種腫瘤分子標志物[7]。CRC早期診斷和判斷預后的分子指標對于提高CRC患者的生存率、改善患者生存質量以及降低復發風險都至關重要。本研究采用免疫組化方法檢測結直腸癌癌前病變組織樣本以及結直腸癌組織樣本中MLH1和CK20的表達，分析其在結直腸癌中的表達及臨床病理特征，同時也為早期發現高危患病人群以及結直腸癌的臨床治療和預后提供相關科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月至2020年12月我院經手術完整切除的結直腸病變組織學標本，根據2010版WHO消化系統腫瘤分類標準進行重新分類[5]，由資深病理醫生對于標本共同進行確認，最終篩選出鋸齒狀病變組織樣本80例，其中男性和女性分別為50例和30例，年齡25～81歲，中位年齡62歲。根據組織學分類，其中增生性息肉(HP)、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤(SSA/P)和傳統鋸齒狀腺瘤(TSA)分別為39例、16例和25例，并收集結腸鏡檢及相關臨床資料。

此外還收集了我院2016年1月至2020年12月確診的結直腸癌患者腫瘤組織標本48例，其中男性和女性分別為27例和21例，年齡48～83歲，中位年齡62歲。每個患者病理切片均經病理醫生確診為CRC，其中高分化、中分化和低分化CRC患者分別為8例、31例和9例；臨床分期：Ⅰ期患者有5例，Ⅱ期患者有23例，Ⅲ期患者有16例，Ⅳ期患者有4例，所有患者的臨床資料保留均較完整。

1.2 方法所有標本均由10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，采用免疫組化MaxVision二步法檢測樣本中MLH1和CK20的表達水平。對于石蠟標本切片，采用血清室溫封閉，然后分別加入MLH和CK20一抗孵育，再加二抗孵育，上述每個步驟均用PBS清洗3次，每次清洗5min，之后通過DAB顯色，蘇木素復染，然后常規脫水、透明、封片，最后進行觀察。MLH1抗體試劑購自福州邁新公司，CK20抗體試劑購自中杉金橋生物。

1.3 結果判定根據染色強度和陽性細胞率分析MLH1和CK20表達水平。染色判定標準為：無著色，陰性0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色，陽性3分。陽性細胞百分率的判定標準為：≤10%(0分)，10%～25%(1分)，25%～50%(2分)，50%～75%(3分)，＞75%(4分)。陽性表達的判斷：染色評分與陽性細胞數相乘≥2分。

1.4 統計學分析運用SPSS 22.0統計軟件對研究結果進行分析，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗。設P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

在80例結直腸癌前變組織標本中，增生性息肉(HP)、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤(SSA/P)和傳統鋸齒狀腺瘤(TSA)分別為39例、16例和25例。MLH-1蛋白陽性表達位于細胞核，在HP、SSA/P和TSA中錯配修復基因MLH-1蛋白表達率在分別為97.4%(38/39)、75.0%(12/16)和64.0%(16/25)，見表1。

表1 結直腸癌前病變組織中錯配修復基因ML1的蛋白表達情況

表1 結直腸癌前病變組織中錯配修復基因ML1的蛋白表達情況

類型 例數 MLH1[n(%)]表達 缺失增生性息肉 39 38(97.4) 1(2.6)無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤 16 12(75.0) 4(25.0)傳統鋸齒狀腺瘤 25 16(64.0) 9(36.0)

2.2 結直腸癌前病變組織中CK20蛋白表達率如表2所示，在HP、SSA/P和TSA組織樣本中，CK20的表達的陽性率分別為20.5%(8/39)、56.2%(9/16)和72.0%(18/25)，呈逐漸上升趨勢。

表2 結直腸癌前病變組織中CK20的蛋白表達情況

對48例CRC組織標本通過免疫組化方法對MLH1蛋白進行檢測，結果顯示有17例患者存在MLH1蛋白表達缺失，其中男性患者9例，女性患者8例，MLH1整體蛋白表達缺失率為35.4%(17/48)。在CRC組織中，患者性別、年齡、淋巴結轉移以及TNM分期對MLH1蛋白表達缺失沒有影響(P＞0.05)，MLH1蛋白表達缺失主要與分化程度有關。在低分化腺癌患者中，MSH1表達缺失明顯高于中分化和高分化腺癌患者(P＜0.05)，表明細胞分化程度較低的結直腸癌患者更易發生MLH1蛋白表達缺失，見表3。

表3 在結直腸癌組織中ML1的表達情況

表3 在結直腸癌組織中ML1的表達情況

臨床特征 例數 MLH1[n(%)] P缺失 表達性別 男 27 9(33.3) 18(66.7) 0.859女 21 8(38.1) 13(61.9)年齡 ＜60 26 9(34.6) 17(65.4) 0.747≥60 22 8(36.4) 14(63.6)分化程度 高分化 8 2(25.0) 6(75.0) ＜0.001中分化 31 10(32.3) 21(67.7)低分化 9 5(55.6) 4(44.4)淋巴結轉移 有 16 6(37.5) 10(62.5) 0.761無 32 11(34.4) 22(65.6)TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期 28 9(32.1) 19(67.9) 0.296Ⅲ～Ⅳ期 20 8(40.0) 13(60.0)

2.4 CRC組織中CK20表達率與臨床病理特征的關系在收集的48例CRC患者組織標本中，經檢測發現CK20的陽性表達率為89.6%(43/48)，患者性別、年齡以及有無淋巴結轉移不影響CK20的表達水平(P＞0.05)，CK20的表達水平主要與分化程度有關。低分化CRC患者CK20表達水平為100%(9/9)，中分化CRC患者CK20表達水平為90.3%(28/31)，高分化的CRC患者CK20表達水平為75%(6/8)，差異具有統計學意義。見表4。

表4 在結直腸癌組織中CK20的表達情況

3 討 論

結直腸癌是胃腸道系統中的一種異質性惡性腫瘤，它的發生與多種因素，比如生活方式(吸煙、飲酒等)、飲食結構等生活因素以及環境因素、遺傳因素等有關，這些因素均可引起多基因的改變。正常人體內都有著一套非常完善的DNA錯配修復體系，它可以防止DNA在復制的過程中出現異常或者缺失，從而保證細胞基因組的穩定性和完整性[8-9]。然而，當錯配修復蛋白出現突變或缺失時，細胞內的DNA序列會出現增多或丟失，從而引起細胞出現突變或癌變[10]。

結直腸癌變中的鋸齒狀癌變通路是近年來提出的一條新的癌變途徑，在鋸齒狀癌變通路中，錯配修復(MMR)基因表達缺失發揮著重要的作用[11]。錯配修復基因包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等，其中MLH1發揮主要的作用。近年來在結直腸癌中關于MLH-1的研究逐漸開始增多，而在結直腸癌變中的研究卻并不多。本研究通過免疫組化方法檢測了增生性息肉、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤組織中MLH-1蛋白的表達情況，發現在增生性息肉、無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤組織中MLH1表達率分別為97.4%、75.0%和64.0%，呈現出逐漸降低的趨勢，故推測MLH-1基因的表達與結直腸鋸齒狀癌變通路具有一定的相關性，隨著癌變程度的加劇，MLH1缺失率依次遞增。此外，本研究還對48例CRC組織標本進行MLH1蛋白表達的檢測，結果發現有17例患者存在MLH1的表達缺失，MLH1蛋白表達缺失率為35.4%。在本研究結果中發現，患者性別、年齡、淋巴結轉移以及TNM分期對MLH1蛋白表達缺失沒有影響(P＞0.05)，MLH1蛋白表達缺失主要與分化程度有關(P＞0.05)，分化程度越低，越容易出現MLH1蛋白表達的缺失。

據文獻報道，早期結直腸癌患者的5年生存率可以達到將近90%，但多數結直腸癌患者確診時已到中晚期，對于晚期的患者，生存率顯著下降[12]。因此，鑒別結直腸癌前病變是早期預防結直腸癌的關鍵，特別是早期識別可以發展為癌的無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤更加重要，繼而在病變發生發展的早期階段進行干預，從而達到早期預防和治療的目的。CK20是分布于上皮細胞中間纖維絲的多肽，當細胞出現惡化增殖時，CK20呈現高強度的表達狀態。本研究結果顯示，在無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤組織樣本中，CK20表達率明顯較高；而在增生性息肉中，CK20的表達率相對較低，提示增生性息肉與無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤具有不同的分子生物學進程，無蒂鋸齒狀息肉或腺瘤和傳統鋸齒狀腺瘤有很大可能向腫瘤方面演變。在48例CRC患者組織標本中，CK20的陽性表達率為89.6%，在分化程度較高的CRC患者組織中CK20的表達率均較高，這提示CK20可能為結直腸癌發病的關鍵基因之一，參與了腫瘤發生、發展、侵襲的整個過程。

綜上所述，檢測錯配修復蛋白MLH1和CK20在結直腸癌前病變與結直腸癌中的表達對于判斷疾病進展，疾病病情、疾病治療和疾病預后方面都有很重要的價值。通過早期篩查錯配修復蛋白MLH1及CK20的表達情況，評估患者的病情狀況，降低癌變的發生，改善患者預后。