哈茨木霉NBL-Z1定殖動態及對草莓根腐病防治效果

齊素敏 冉新炎 韓廣泉 陶寧 陳丹丹 李圓圓 王麗榮

摘要：本研究測定哈茨木霉NBL-Z1菌株無菌發酵濾液對5種病原菌的拮抗活性，并檢測該菌的定殖能力及對草莓根腐病的防治效果，以期篩選出對病原真菌具有良好拮抗效果、安全、高效的生防菌。結果表明，哈茨木霉NBL-Z1菌株無菌發酵濾液對5種供試病原真菌有較強的拮抗作用，處理96、144 h，NBL-Z1菌株對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑菌率均為100.00%;接種后28 d，菌株NBL-Z在草莓根表定殖數量達到最大，為8.10×107 CFU/g;NBL-Z1菌株對盆栽草莓根腐病的防效為65.6%，同時可促進盆栽草莓植株生長，提高果實產量。研究表明，NBL-Z1菌株能有效防治草莓根腐病并促進草莓植株生長，具有較高的潛在應用價值。

關鍵詞：哈茨木霉;拮抗活性;尖孢鐮刀菌;定殖能力;草莓根腐病

中圖分類號：S436.68+4?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0124-04

收稿日期：2020-12-15

基金項目：山東省2018年重點研發計劃（編號：2018JHZ012）;泰山產業領軍人才（編號：魯政辦字〔2018〕246號）;2017年“外專雙百計劃”（編號：魯政辦字〔2017〕144號）;2020年度山東省重點扶持區域引進急需緊缺人才項目（編號：泰發改區域〔2020〕352號）。

作者簡介：齊素敏（1989—），女，山東沂源人，碩士，助理研究員，主要從事植物微生態制劑的研發工作。E-mail：qsm20095089@126.com。

木霉菌（Trichoderma spp.）屬半知菌亞門木霉屬，該類菌適應力強，分布廣泛，是一類重要的生防真菌[1]，常見的木霉有綠色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）等。據報道，木霉菌已成功用于防治番茄灰霉病[2]、番茄枯萎病[3]、黃瓜枯萎病[4]、花生根腐病[5]等植物病害，該類菌對植物病害起到防控作用的機制主要歸結于競爭[6]、誘導抗性[7-8]、重寄生[9]、抗生等。

哈茨木霉（T. harzianum）是一種常見的木霉菌，該菌對多種病原菌具有較強的抑制效果。Zhang等研究發現，哈茨木霉對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制率可達70.99%[10]。據報道，哈茨木霉對尖孢鐮刀菌、核盤菌、鏈格孢菌等植物病原菌具有明顯的拮抗作用[11]。Swehla等研究了哈茨木霉對芝麻莖點枯病菌的抑制效果，結果表明菌絲體生長抑制率為76.96%[12]。有關哈茨木霉對尖孢鐮刀菌的抑制作用，及哈茨木霉在草莓根系定殖能力及對草莓根腐病的防治效果的研究較少。本研究以哈茨木霉NBL-Z1菌株為試驗材料，通過室內拮抗試驗發現該菌對5種供試病原真菌均具有抑制效果，后研究NBL-Z1菌株在草莓根際的定殖能力，以及其對草莓根腐病的防治效果和促生作用，以期為防治草莓根腐病等土傳病害的生防菌劑的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

哈茨木霉NBL-Z1菌株于土壤中分離純化獲得。該菌株目前保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC19602。

PDB培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 菌株NBL-Z1無菌發酵濾液抑菌活性測定

將NBL-Z1菌株接種到PDB培養基中，于28 ℃、180 r/min 恒溫搖床中培養120 h后，10 000 r/min離心，用0.22 μm微孔濾膜過濾得無菌發酵濾液，按體積1 ∶9的比例將其與冷卻至50 ℃左右的滅菌PDA培養基混勻，倒入滅過菌的平皿中，待平皿冷凝后將直徑為9 mm的病原真菌菌餅置于平板中央，以普通PDA培養基平板為對照，于28 ℃光照培養箱中培養，用十字交叉法分別于96、144 h測量菌落直徑，并計算相對抑菌率。相對抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3 菌株NBL-Z1在草莓根系定殖量的檢測

本試驗于2019年12月在山東省泰安市寧陽縣鄉飲鄉（116.80°E，35.77°N）巴夫生態大棚進行。

將 NBL-Z1菌株于PDB 培養液中培養120 h后，用4 層滅菌濾紙過濾，加無菌水制成分生孢子懸浮液，用血球計數板計數調整濃度為1.0×107 CFU/mL。每株草莓灌根接種 10 mL 該菌孢子懸浮液。分別于接種NBL-Z1 菌株后1、7、14、21、28、35 d取樣進行定殖量的檢測。切取草莓根組織，轉移至離心管中。向離心管中加入 1 mL 1×PBS 和玻璃珠若干，依次超聲振蕩 1 min，漩渦振蕩 1 min，冰浴 1 min，重復 3 次。將獲得的菌懸液梯度稀釋10～106倍，吸取 200 μL 菌懸液涂布于PDA培養基平板，于28 ℃培養120 h，記錄平板上的菌落數，計算菌株NBL-Z1 在草莓根系的定殖量。

1.4 菌株NBL-Z1的防病作用

試驗設3個處理：對照（CK）、單接病原菌（P）、同時接種病原菌和NBL-Z1菌株（P+NBL-Z1）。每個處理重復20棵番茄。分別刮取PDA培養基平板上 28 ℃、培養120 h的尖孢鐮刀菌孢子和NBL-Z1菌株，分散到0.1%吐溫-80溶液中制成孢子懸液，調整病原菌和生防菌的濃度至1.0×107 CFU/mL。采取傷根灌注法[13]同時接種病原菌和生防菌，各菌株接種量均為每棵10 mL。接種50 d后挖取植株，統計發病程度，計算病情指數、防效，測定植株鮮質量、單株產量及葉綠素含量（SPAD值）。

根腐病發病程度分為6級：0級為根系未發病;1級為根系發病率≤30%，葉片正常;2級為30%<根系發病率≤60%，葉片正常;3級為60%<根系發病率≤80%，葉片變黃;4級為根系發病率>80%，葉片枯萎;5級為整株死亡，葉片干枯[14]。

病情指數=[∑（各病級株數×各病級代表值）/（總株數×最高病級代表值）]× 100;

防效=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數× 100%。

1.5 數據統計與分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行Duncans顯著性分析和Probit法回歸分析。

2 結果與分析

2.1 菌株NBL-Z1對病原菌的抑制作用

從表1可以看出，NBL-Z1菌株無菌發酵液對5種病原真菌菌絲生長均具有較強的抑制作用。NBL-Z1菌株對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制效果最好，處理96、144 h，抑菌率均為100.00%（圖1）。處理96 h后，NBL-Z1菌株對鏈格孢的菌絲生長抑菌率達94.61%（圖2），但對立枯絲核菌的抑菌率僅為49.17% 。培養144 h，NBL-Z1菌株對鏈格孢的菌絲生長抑菌率為90.38%，對其他病原真菌的菌絲生長抑菌率為56.52%～82.54%。總體來看，NBL-Z1 菌株對5種病原真菌96 h的拮抗效果優于144 h。

2.2 菌株NBL-Z1在草莓根域的定殖

植物根際促生菌在植物根際定殖能力是影響其生防效果的重要原因之一，是發揮其有益功能的前提。為了檢測NBL-Z1菌株在草莓根表的定殖，在NBL-Z1菌株接種后的1、7、14、21、28、35 d采集根系樣品，分離并培養定殖于根表的NBL-Z1菌株，統計其定殖量。由圖3可知，接種后1 d，NBL-Z1菌株在草莓根表的定殖量為0.68×107 CFU/mL，隨著草莓的生長，該菌株在草莓根表的定殖量逐漸增加，接種后28 d，NBL-Z1菌株的定殖量達到最大，為 8.10×107 CFU/mL。接種后35 d，NBL-Z1菌株的定殖量略微下降，為6.47×107 CFU/mL。試驗結果表明，哈茨木霉菌能夠在草莓根際土壤中定殖和生長繁殖，定殖量呈現先增加后降低的動態變化過程。

2.3 NBL-Z1菌株對草莓防病促生的作用

由表2可知，接種NBL-Z1菌株可促進接種根腐病原菌尖孢鐮刀菌的草莓生長，提高其產量，降低根腐病發生率。與單接病原菌處理P相比，混合接種NBL-Z1菌株處理的草莓植株鮮質量、單株產量分別增加28.17%、25.92%。接種NBL-Z1菌株

處理組草莓葉綠素含量顯著增加，較單接病原菌組增加27.89%。

以上結果表明，混合接種NBL-Z1菌株不僅能促進草莓生長發育，提高其光合指標，還能有效降低草莓根腐病的發病率，防效為65.6%。

3 討論與結論

草莓根腐病是草莓生產中的一種主要病害，該病由多種土傳病原真菌復合侵染所致[15-16]，其中尖孢鐮刀菌是重要的病原菌之一[17]。近年來，利用微生物防治植物病蟲害具有安全、環保、高效等優勢已經成為了研究熱點。陳哲等研究發現，解淀粉芽孢桿菌CM3菌株對尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病的防治效果達到了 64.86%[17]。王占武等的田間試驗結果表明，枯草芽孢桿菌B501菌株對草莓根腐病的防效高達94%[18];Kurze等研究發現，沙雷氏菌HRO-C48菌株可有效降低草莓根腐病的發生[19]。孫敬祖等研究報道，放線菌Act12菌劑對草莓根腐病的相對防效為84.7%[20]。除生防細菌和放線菌外，一些真菌如哈茨木霉[14，21]、鉤木霉[22]等木霉菌對草莓根腐病也具有良好效果。本研究發現，哈茨木霉NBL-Z1菌株對尖孢鐮刀菌96 h的抑菌率可達100. 00%;NBL-Z1菌株能夠在草莓根際土壤中穩定定殖，接種后28 d，在草莓根表定殖數量為8.10×107 CFU/g;在田間條件下，NBL-Z1菌株對草莓根腐病具有良好的防治效果，防效為65.6%。

大量研究表明，木霉菌能促進植株生長，改善植物營養狀況[23-24]。郭成瑾等研究發現，哈茨木霉處理的馬鈴薯株高、莖粗和分枝數均明顯高于對照[25]。Es-Soufi等研究發現，哈茨木霉可以促進植物發育并延長其開花和結果的持續時間[26]。李松鵬等研究報道，哈茨木霉發酵液有利于促進種子發芽與生長的作用[27]。本試驗中，用哈茨木霉 NBL-Z1 無菌上清液澆灌草莓植株，發現處理組的草莓植株鮮質量、單株產量和葉綠素含量分別增加28.17%、25.92%、27.89%。說明哈茨木霉 NBL-Z1菌株能夠有效促進草莓植株的生長。

本研究結果表明，哈茨木霉NBL-Z1無菌發酵濾液對5種供試病原真菌有較強的拮抗作用，處理后96、144 h，NBL-Z1菌株對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑菌率均為100. 00%;接種后28 d，NBL-Z菌株在草莓根表定殖數量最大，為8.10×107 CFU/g;菌株NBL-Z1對草莓根腐病的防效為65.6%，同時可促進盆栽草莓植株生長，提高果實產量。在接下來的研究中，我們將檢測NBL-Z1菌株對根系土壤中其他微生物的影響，并補充相應的田間使用規范等。

哈茨木霉NBL-Z1菌株能有效防治草莓根腐病并促進草莓植株生長，具有較高的潛在應用價值。

參考文獻：

[1]Srivastava R K，Singh R K，Prasad R D. Relative antogonistic effect of different isolates of Trichoderma viridi and Trichoderma harzanium against Rhizoctonia solani[J]. National Academy Science Letters，2012，35（1）：49-52.

[2]劉波微，彭化賢，陳素清. 番茄灰霉病拮抗木霉菌的篩選及效果評價[J]. 西南農業學報，2007，20（4）：650-653.

[3]康萍芝，張麗榮，沈瑞清，等. 哈茨木霉制劑對設施連作番茄根際土壤微生物的生態效應及防病作用[J]. 農藥，2013，52（2）：128-131.

[4]莊敬華，高增貴，楊長城，等. 綠色木霉菌T23對黃瓜枯萎病防治效果及其幾種防御酶活性的影響[J]. 植物病理學報，2005，35（2）：179-183.

[5]陳建愛，陳為京，劉鳳吉. 黃綠木霉T1010對花生根腐病生防效果研究[J]. 生態環境學報，2018，27（8）：1446-1452.

[6]梁巧蘭，王 芳，魏列新，等. 深綠木霉T2菌株對百合疫霉病菌拮抗作用及機制[J]. 植物保護，2011，37（6）：164-167.

[7]Bae H，Roberts D P，Lim H S，et al. Endophytic Trichoderma isolates from tropical environments delay disease onset and induce resistance against Phytophthora capsici in hot pepper using multiple mechanisms[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2011，24（3）：336-351.

[8]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the fungal biocontrol agent Trichoderma atroviride to enhance both antagonism and induction of plant systemic disease resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3965.

[9]Kubicek C P，Herrera-Estrella A，Seidl-Seiboth V，et al. Comparative genome sequence analysis underscores mycoparasitism as the ancestral life style of Trichoderma[J]. Genome Biology，2011，12（4）：R40.

[10]Zhang S X，Sun F F，Liu L J，et al. Dragonfly-associated Trichoderma harzianum QTYC77 is not only a potential biological control agent of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum but also a source of new antibacterial agents[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2020，68（48）：14161-14167.

[11]Wang Y F，Hou X Y，Jiang C Y，et al. A native Trichoderma harzianum strain Th62 displays antagonistic activities against phytopathogenic fungi and promotes the growth of Celosia cristata[J]. Horticulture，Environment，and Biotechnology，2021，62（2）：169-179.

[12]Swehla A，Pandey A K，Nair R M. Bioactivity of Trichoderma harzianum isolates against the fungal root rot pathogens with special reference to Macrophomina phaseolina causing dry root rot of mungbean[J]. Indian Phytopathology，2020，73（4）：787-792.

[13]孫廣宇，宗兆鋒. 植物病理學實驗技術[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

[14]Vestberg M，Kukkonen S，Saan K，et al. Microbial inoculation for improving the growth ecology，and? health of micropropagated strawberry[J]. Applied Soil，2004，27（3）：243-258.

[15]張悅麗，張 博，任鳳山，等. 草莓腐霉根腐病病原菌鑒定[J]. 植物保護學報，2015，42（3）：477-478.

[16]Fang X L，Finnegan P M，Barbetti M J. Wide variation in virulence and genetic diversity of binucleate Rhizoctonia isolates associated with root rot of strawberry in Western Australia[J]. PLoS One，2013，8（2）：e55877.

[17]陳 哲，黃 靜，趙 佳，等. 草莓根腐病的病原菌分離鑒定及拮抗菌CM3的抑制作用研究[J]. 生物技術通報，2018，34（2）：135-141.

[18]王占武，李曉芝，劉彥利，等. 枯草芽孢桿菌B501在草莓根際的定殖及其動態變化[J]. 植物病理學報，2003，33（2）：188-189.

[19]Kurze S，Bahl H，Dahl R，et al. Biological control of fungal strawberry diseases by Serratia plymuthica HRO-C48[J]. Plant Disease，2001，85（5）：529-534.

[20]孫敬祖，薛泉宏，唐 明，等. 放線菌制劑對連作草莓根區微生物區系的影響及其防病促生作用[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2009，37（12）：153-158.

[21]Lamondia J A，Cowles R S. Effect of entomopathogenic nematodes and Trichoderma harzianum on the strawberry black root rot pathogens Pratylenchus penetrans and Rhizoctonia fragariae[J]. Journal of Nematology，2002，34（4）：351-357.

[22]Olatimvo R O，Sabaratnam S，Schilder A C. Trichoderma stromaticum：a potential biological control agent for black root rot in strawberries[J]. Phytopathology，2004，94（6）：S78-S78.

[23]Harman G E，Howell C R，Viterbo A，et al. Trichoderma species-opportunistic，avirulent plant symbionts[J]. Nature Reviews Microbiology，2004，2（1）：43-56.

[24]葉旻碩，俞鍵烽，馬 艷，等. 不同微生物菌劑對辣椒疫病的防控效果及對土壤性狀的影響[J]. 江蘇農業學報，2019，35（4）：811-817.

[25]郭成瑾，沈瑞清，張麗榮，等. 哈茨木霉協同秸稈對馬鈴薯黑痣病及根際土壤微生態的影響[J]. 核農學報，2020，34（7）：1447-1455.

[26]Es-Soufi R，Tahiri H，Oualkadis A E，et al. Evaluation of plant growth promoting ability of Bacillus amyloliquefaciens Bc2 and Trichoderma harzianum TR in vivo[J]. Agricultural Sciences，2020，11（3）：247-259.

[27]李松鵬，崔琳琳，程家森，等. 兩株哈茨木霉菌株防治水稻紋枯病及促進水稻生長的潛力研究[J]. 植物病理學報，2018，48（1）：98-107.