基于InDel標(biāo)記的新疆色素辣椒遺傳多樣性及聚類分析

李輝玲 張國(guó)儒 曾衛(wèi)東 賽買提江?艾依提 王國(guó)洪 張建文

摘要：利用雜種優(yōu)勢(shì)的方式有效提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的先決條件是全面系統(tǒng)地掌握色素辣椒親本的遺傳背景，包括遺傳差異、遺傳距離等，從而可預(yù)見性地選育高產(chǎn)高抗雜交種。利用240對(duì)InDel引物對(duì)30份新疆色素辣椒地方材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用軟件Ntsys 2.10對(duì)電泳后的多態(tài)性條帶進(jìn)行聚類分析。本研究最終檢測(cè)出23對(duì)特異性引物，將參試材料分為3類，有效區(qū)分出不同品種資源間基因的內(nèi)部差異。InDel分子標(biāo)記技術(shù)系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了各資源間的遺傳距離和親緣關(guān)系情況，為雜交育種工作中選配親本提供了一定的理論參考和指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：色素辣椒;遺傳多樣性;InDel分子標(biāo)記;聚類分析;雜交組合

中圖分類號(hào)：S641.303?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）17-0067-04

收稿日期：2021-01-07

基金項(xiàng)目：巴音郭楞蒙古自治州財(cái)政支持基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：202008、202104）。

作者簡(jiǎn)介：李輝玲（1988—），女，甘肅蘭州人，碩士，助理研究員，主要從事特色作物的育種與栽培。E-mail：12354399@qq.com。

通信作者：張建文，碩士，副研究員，主要從事加工番茄、色素辣椒等作物的育種與栽培。E-mail：1220743143@qq.com。

辣椒屬于茄科（Solanaceae），是全球第三大作物，隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度迅猛，逐漸成為我國(guó)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)[1-2]。用于工業(yè)萃取辣椒紅色素的辣椒即色素辣椒，20世紀(jì)90年代初，新疆開始大范圍、規(guī)?；N植色素辣椒，因其紅色素含量和產(chǎn)量高且病蟲害少而被國(guó)際市場(chǎng)青睞，成為新疆“紅色產(chǎn)業(yè)”重要組成之一[3]。色素辣椒新品種選育的過程包括自交系選擇、雜交試配和品種比較試驗(yàn)等，其中，雜種優(yōu)勢(shì)利用是色素辣椒新品種選育的重要途徑[4]，而試配親本的親緣關(guān)系是重要指標(biāo)。傳統(tǒng)育種通常依據(jù)田間作物的直觀表型性狀來分析親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，譬如生產(chǎn)中關(guān)鍵的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)——產(chǎn)量，是育種中判斷新品種雜種優(yōu)勢(shì)的重要標(biāo)準(zhǔn)[5]，屬于數(shù)量性狀遺傳，受環(huán)境影響大，通過表型性狀選擇的效率低。分子標(biāo)記技術(shù)可以使育種者在作物幼苗期、DNA層面上了解各個(gè)材料的遺傳距離和親緣關(guān)系，快速準(zhǔn)確地鑒定出遺傳差異。

分子標(biāo)記技術(shù)常用于育種工作中對(duì)作物資源的遺傳多樣性及遺傳背景、遺傳距離的研究?；谌蚪M的分子標(biāo)記在辣椒中已有應(yīng)用，但利用InDel標(biāo)記對(duì)新疆色素辣椒種質(zhì)資源遺傳分析和聚類研究的報(bào)道較少。插入缺失長(zhǎng)度多態(tài)性（insertion-deletion length polymorphism，InDel）是近緣種或同一物種不同個(gè)體間基因組DNA插入或缺失部分核苷酸的現(xiàn)象，即同源的序列相比，某一個(gè)位點(diǎn)有插入或缺失部分堿基的情況[6]。InDel標(biāo)記作為新一代分子標(biāo)記[7]，在基因組中分布廣泛、數(shù)量眾多，多應(yīng)用于分子輔助育種、動(dòng)植物群體遺傳分析等相關(guān)研究[8-10]。借助InDel分子標(biāo)記技術(shù)分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性，有助于優(yōu)異品質(zhì)性狀的改良[11]。本研究采用240對(duì)InDel引物對(duì)30份地方色素辣椒資源進(jìn)行遺傳多樣性分析評(píng)價(jià)，快速準(zhǔn)確地判斷材料間的遺傳距離，為后續(xù)色素辣椒育種中雜交親本選配及品種遺傳改良提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的30份試驗(yàn)材料（表1）均由巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院特色作物研究室辣椒課題組提供，其中有本課題組培育的品種（新椒29號(hào)）、保存的部分高代自交系材料和其他地區(qū)收集的材料（共7份），于2020年10月在人工氣候室播種育苗，每份材料育苗40株。

1.2 方法

1.2.1 辣椒DNA提取

每份材料隨機(jī)采集約 100 mg 新鮮嫩葉，置于1.5 mL試管中，放入2粒鋼珠，經(jīng)液氮處理后，采用高通量組織研磨器進(jìn)行破碎研磨。按照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：DP320）步驟提取各材料的基因組DNA。采用核酸檢測(cè)儀（NanoDrop-1000）及1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行純度、濃度檢測(cè)，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，并將提取的DNA原液于 -20 ℃ 冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系（總體積10 μL）：模板DNA 3.5 ng/μL、上下游引物0.5 μmol/L和 2×Taq PCR Mix 5.0 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，不同引物最佳退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;所得產(chǎn)物4 ℃冰箱保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠、北京六一電泳儀廠的DYY-12型電泳儀（200 V，400 mA，100 W，60 min），銀染法顯色后在醫(yī)用膠片觀察燈上，觀察并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)擴(kuò)增后的條帶進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)帶型構(gòu)建（0，1）矩陣（0代表無條帶，1代表有條帶）存入Excel表格中[12-13]。利用Ntsys 2.10軟件計(jì)算30份地方資源的遺傳相似系數(shù)，按照非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析[14]，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板的檢測(cè)

由圖1可知，圖譜中條帶整齊清晰未見拖尾，樣品間濃度較為均勻，所提DNA質(zhì)量測(cè)定值D260 nm/D280 nm的比值位于1.8～2.0，濃度在237～92 ng/μL。結(jié)果表明，提取的DNA純度高并且結(jié)構(gòu)完整，可以稀釋一定比例后用于后續(xù)InDel-PCR分析。

2.2 InDel引物多態(tài)性分析

隨機(jī)挑選8個(gè)色素辣椒基因組DNA組成小群體，對(duì)240對(duì)InDel引物進(jìn)行擴(kuò)增，淘汰效果欠佳、帶型不好辨認(rèn)的引物，篩選出23對(duì)引物（表2）。由圖2可知，30份材料有特異性條帶，特異性檢出率為9.58%。由表3可知，共擴(kuò)增出166條帶，多態(tài)性帶71條，多態(tài)性比率為42.8%。

2.3 聚類結(jié)果

采用Ntsys 2.10軟件對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算30份色素辣椒材料之間的遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明，各材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.24～1.00間，供試30份色素辣椒種質(zhì)資源總體表現(xiàn)遺傳差異較小，遺傳基礎(chǔ)狹窄。對(duì)30份色素辣椒材料進(jìn)行UPGMA聚類分析，由圖3可知，在遺傳相似系數(shù)0.64處將30份地方色素辣椒材料分為3個(gè)類群，其中，第一類群包含13份材料，分別為1、10、2、15、16、 17、5、6、11、18、41、12、37; 第二類群包含8份材料，分別為8、32、20、21、35、22、33、9;第三類群包含9份材料，分別為4、28、36、13、14、34、7、38、19。

3 討論與結(jié)論

中國(guó)辣椒萃取工業(yè)發(fā)展迅猛，在世界辣椒紅產(chǎn)量和辣椒規(guī)?；a(chǎn)市場(chǎng)中占據(jù)很大份額[15-17]。色素辣椒國(guó)際貿(mào)易定價(jià)中，色價(jià)是決定性關(guān)鍵指標(biāo)[16]，高色價(jià)是色素辣椒選育的重要目標(biāo)，高色價(jià)品種會(huì)給農(nóng)戶和辣椒紅色素萃取工業(yè)帶來更加豐厚的利潤(rùn)回報(bào)。近年來，辣椒種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，引進(jìn)品種和地方品種混雜無據(jù)、自留種連年退化等現(xiàn)狀直接影響辣椒紅色素產(chǎn)業(yè)的整體穩(wěn)步、 持續(xù)健康發(fā)展，用遺傳多樣性對(duì)辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行分析評(píng)價(jià)并輔助雜交育種的親本選配尤為重要。鑒于此，本研究搜集了30份色素辣椒材料，采用InDel分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳相似性與聚類分析，聚類分析是品種遺傳背景差異度評(píng)價(jià)工作中廣泛使用的技術(shù)手段[18-21]，本試驗(yàn)的目的是對(duì)現(xiàn)有的地方色素辣椒材料進(jìn)行客觀評(píng)估，為今后色素辣椒育種提供參考依據(jù)和指導(dǎo)。

本研究從240對(duì)引物中篩選出有特異性條帶的引物23對(duì)，通過對(duì)30份色素辣椒材料進(jìn)行擴(kuò)增，最終將30份材料分為3個(gè)類群，通過表型性狀比對(duì)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)類群均有相似或相近的特點(diǎn)。試驗(yàn)中篩選得出的23對(duì)引物能夠有效區(qū)分材料之間的差異，在DNA分子層面評(píng)價(jià)了地方色素辣椒品種間的遺傳多樣性和遺傳背景差異，此結(jié)果為今后色素辣椒種質(zhì)的搜集、利用和遺傳改良提供一定的理論基礎(chǔ)并對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐有一定的指導(dǎo)意義。

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