成都平原豇豆根腐病菌的分離與鑒定

陳 玲，向 娟，張河慶， 席亞東，羅小波，付紹紅

1. 成都市農林科學院，成都 611130； 2. 四川省農業科學院 植物保護研究所/蔬菜品種改良與種質創新四川省重點實驗室，成都 610066

豇豆是深受人們喜愛的一種豆類蔬菜，鮮食與加工需求量大．近年來，隨著豇豆種植集約化程度與復種指數增高，土傳豇豆根腐病發生嚴重，成為制約豇豆產業發展的重要因素[1]．據報道，引起豇豆根腐病的病原菌種類較多，如鐮孢菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Phythiumsp.)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等[2-4]，其中，鐮孢菌是主要致病菌，在各種植區均有發生，已發現的豇豆根腐病鐮孢菌包括茄腐鐮孢菌(F.solani)、尖鐮孢菌(F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌(F.solani)等11種鐮孢菌[5-8]．受鐮孢菌侵染后，植株根莖部和主根變成紅褐色，病部稍凹陷，有的開裂深達皮層內；剖視莖部，可見維管束變褐，病株側根脫落或腐爛死亡；當主根全部腐爛時，病株即枯萎死亡[9]．由于鐮孢菌可在田間病殘體、土壤表面或耕作層中越冬，且其種類復雜，寄主范圍廣，使得豇豆鐮孢菌根腐病防治困難[10]．雖然使用抗性品種是防治豇豆根腐病最理想的方法，但目前生產上可用的抗鐮孢根腐病菌的豇豆品種仍十分缺乏．

豇豆作為四川成都平原的主要栽培蔬菜之一，主要用于鮮食和泡菜加工．近年來，成都平原豇豆規模化種植面積達到5萬hm2，年總產量約70萬t，均明顯高于菜豆[1]．但因當地涼爽、潮濕的氣候特點，加之集約化、規模化種植，使得豇豆根腐病發生普遍，特別是成都平原的雙流、彭州、金堂等地有些田塊發病率達到100%[11]．2018年，張河慶等[11]首次發現并報道了成都地區豇豆根腐病一種新病原菌——共享鐮孢菌(Fusariumcommune)，但關于成都平原豇豆根腐病的病原種類還未見報道．本研究對成都平原豇豆主產區的根腐病株進行收集，通過對病原菌的分離純化，采用形態學與分子生物學方面進行鑒定，旨在明確引起該地區豇豆根腐病的主要致病菌類群，為生產上有針對性地防治該病以及抗病育種提供一定的科學依據．

1 材料與方法

1.1 病害調查與病株采集

2016-2019年課題組對成都平原豇豆主產區開展了調查，在發病嚴重的彭州、崇州、雙流、眉山、樂山、金堂等6個采樣點采集了田間病害樣本．

1.2 病原菌的分離與鑒定

1.2.1 病原菌分離與致病性測定

參照方中達[12]《植病研究方法》中的方法進行病原菌的分離與鑒定．選取新發病豇豆植株莖基部的根莖進行常規組織分離，經純化培養后進行單孢分離，獲得單孢菌株，并置于4 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養基上保存．采用柯赫氏法則(Koch’s Rules)對分離得到的菌株進行致病性測定．將分離到的菌株培養5 d，制成孢子懸浮液(106～107個孢子/mL)，于豇豆幼苗兩葉一心期采用浸根法接種，使根部完全浸泡在孢子懸浮液中30 min，以清水為對照，每個菌株接種10株幼苗，試驗重復3次．接種后將植株定植于裝有無菌泥炭土的營養杯中，于25 ℃氣候箱中培養，12 h光照，8 h暗培養，每隔1～2 d觀察1次．待發病后，從病斑處再次分離病原菌，通過形態及分子鑒定，確認再分離物和接種物的一致性．

1.2.2 病原鑒定

形態學鑒定： 將供試的致病菌株接種到PDA培養基上，25 ℃恒溫黑暗培養，7 d后觀察培養基上的菌落形態及色素產生情況．參照Skovgaard等[13]的報道，進行病原菌種的形態學鑒定．

分子鑒定： 采用改良的CTAB法提取基因組DNA[13]，以核糖體內轉錄區域間隔區(rDNA-ITS)的通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[14]進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其PCR產物，并委托上海生物工程技術服務有限公司進行測序；將所得ITS序列在GenBank數據庫中比對，獲得相似度較高且已報道的病原菌序列；運用軟件MEGA 6.0，采用最大似然法(Maximum likeihood)構建系統發育樹，以確定各病原菌的分類地位．

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離和培養

調查發現田間豇豆根腐病發病癥狀為： 受害根莖部和主根紅褐色，病部稍凹陷，側根脫落或腐爛死亡(圖1)．根據發病癥狀采集病樣進行組織分離，分離物經純化并單孢分離后共獲得122株單孢菌株．通過觀察菌株在PDA培養基上的培養特征，發現分離菌株的氣生菌絲均較茂盛，菌絲初為白色，隨菌齡增長，不同菌株菌落產生顏色不同，根據色素產生情況，大致將病原菌分為12類(表1)．所有菌株在PDA培養基上均不易產生大孢子，小孢子卵圓形至短桿形，有些菌株容易產生厚垣孢子(圖2)，這些特征與鐮孢屬真菌的形態特征相符．因此，初步認定這些病原菌均屬于鐮孢屬(Fusarium)．

圖1 豇豆根腐病田間癥狀

表1 成都平原鑒定出的122株豇豆根腐病病原菌信息

續表1

圖2 豇豆根腐病病原菌的形態學特征

2.2 致病性測定

孢子懸浮液接種在健康豇豆植株上15 d后，觀察植株發病情況．結果看出，部分植株萎蔫、落葉、倒伏，根部開始出現褐色病變，根系壞死腐爛，且維管束呈紅褐色并可延及根莖部，而對照植株不發病．依據柯赫氏法則，從病斑處再次分離菌株經ITS序列分析和病原形態顯微鏡鏡檢發現，病原菌均與原菌株一致(圖3)．

圖3 病原菌回接豇豆后的典型癥狀

再次從回接發病植株上分離的4種鐮孢菌形態特征如下： 尖鐮孢菌小型分生孢子，量大，卵圓形或腎形，5.2～10.2 μm×2.4～3.6 μm；大型分生孢子鐮刀型，1～7隔膜，多數3隔膜，12.1～59 μm×2.5～5.1 μm(圖4a)．茄腐鐮孢菌小型分生孢子，卵形或腎形，8.6～15.5 μm×2.4～3.9 μm；大型分生孢子鐮刀型，孢子形態較短胖，2～8隔膜，多數3隔膜，18.2～45.3 μm×3.2～6.3 μm(圖4b)．輪枝鐮孢菌小型分生孢子串生，2.5～4.2 μm×2.0～2.8 μm；大型分生孢子鐮刀型，2～3隔膜，22.5～41.3 μm×2.6～5.5 μm(圖4c)．層生鐮孢菌小型分生孢子卵形或短棒形，5.2～10.3 μm×2.3～3.5 μm；大型分生孢子舟型，長而直，兩端略彎，20.5～43.5 μm×3.6～4.9 μm(圖4d)．木賊鐮孢菌未在PDA培養基上觀察到小型分生孢子．

圖4 豇豆病根部再分離物形態特征

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

對122株分離物進行分子鑒定，分別將株菌PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得約520 bp的擴增條帶(圖5)．將測序所得序列與NCBI中相關序列進行比對，并結合MEGA軟件進行聚類分析．最后根據形態學和分子生物學特征將122株病原菌分為5種，即茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢、層生鐮孢、木賊鐮孢菌(圖6)．

M： DL2000；4： CY28441；5： CY22813；6： CY2812；7： CY23522；8： CY1.12；9： CY2.51；10： CY22821；11： CY22912；12： CY28443；13： JG2-2.11；14： JG2-3.12；15： JG1-3.31；16： JG2-3.23；17： JG2-4.21；18： LJ2.13；19： LD13．圖5 菌株PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳

其中尖鐮孢共有99個分離物，分離頻率最高，為81.1%，其他病原菌的分離頻率均小于11%(表2)；5類菌株在崇州地區均有出現，且分離的菌株數量最多，雙流分離病原菌只有1種，為尖鐮孢．來自豇豆成株期的17株病原菌均為尖鐮孢，而分離純化自豇豆苗期的105株菌株隸屬于5種不同的鐮孢菌，這表明引起成都平原豇豆根腐病的病原菌主要為鐮孢菌，且多為尖鐮孢，在6個主產區均有分布，并導致植株在苗期和成株期發病．

表2 成都平原豇豆根腐病原菌屬種分布

3 結論與討論

根腐病在四川省豇豆產區擴展很快，嚴重制約了豇豆生產和綠色發展．本研究針對成都平原豇豆根腐病發生嚴重、病原不清的問題，通過采集該地區主要種植地的根腐病病樣，基于形態學和分子鑒定，明確了引起該地區豇豆根腐病的病原菌為鐮孢菌，包括茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢、層生鐮孢、木賊鐮刀菌等5類鐮孢菌，其中以尖鐮孢為優勢致病菌．

目前，國內外已報道可引起豇豆根腐病的鐮孢菌有11 種(https： //nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/)，如茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢等[8]．但豇豆根腐病的致病菌類群及病害發生與栽培方式、品種抗性、土壤菌源量等均有關系．楊玉潔等[15]通過鑒定得出江蘇省如皋市豇豆根腐病原菌主要有茄腐鐮孢、尖孢鐮孢和立枯絲核菌．吳仁峰等[16]鑒定出湖北武漢地區的豇豆根腐病原菌為茄腐鐮孢．李秋潔等[17]從海南省三亞市豇豆主要種植區的19份根腐病病樣中分離到的23株菌株，其中以茄腐鐮孢菌和尖孢鐮孢菌為主．本研究鑒定發現，成都平原豇豆根腐病病原菌主要為茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢、層生鐮孢、木賊鐮刀菌等5類鐮孢菌，其中尖孢鐮孢在豇豆各主產區出現的頻率最高(81.1%)、分布最廣，為豇豆根腐病的主要病原，其次為茄腐鐮孢菌和輪枝鐮孢菌，研究結果與上述報道地區有所不同．這可能與成都平原特殊的氣候條件和栽培品種有關．成都平原屬亞熱帶季風性濕潤氣候，夏季高溫多雨，土壤質地以黑壤土、黃黏土為主，長年連作、化肥過施等因素造成土壤板結、質量下降，為多種植物根腐病的流行性發生提供了環境條件[11，18]；同時，規模化連續種植導致致病鐮孢菌的厚垣孢子能夠在土壤及病殘體中長期積累存活，增加土壤菌源量，從而加重病情．此外，因成都平原種植的豇豆多為綠莢、肉厚、細長品種，尤其以適宜泡漬加工特性的品種為主，這些品種缺乏對根腐病的抗性．

本研究主要針對成都平原發病較為嚴重的豇豆主產區的豇豆根腐病菌進行分離和鑒定，在地理分布和區域方面具有一定的代表性，結果表明崇州地區發現的根腐病病原菌種類、數量最多．閆文雪等[8]對采自山東省和甘肅省的16份豇豆標樣進行分離獲得16個病原，經鑒定均為茄腐鐮孢菌，吳仁鋒等[16]報道的豇豆根腐病種類也為茄腐鐮孢菌(F.solani)．上述兩篇文章并未明確標樣來源為成株期還是苗期，本研究所采的豇豆成株期根腐病病原菌株的17株均為尖鐮孢菌，而苗期根腐病包含上述5種不同的鐮孢菌，表明成株期的根腐病原種類和苗期的根腐病原種群具有一定的差異性．以尖鐮孢菌為主造成其他作物發生根腐病的也有報道，如四川省的大豆根腐病[18]，甘肅省的百合根腐病[19]，黑龍江省的大豆根腐病[20-21]，以及山西省植物病原鐮孢菌以尖鐮孢為優勢種[22]，而成都平原地區還未有此病原菌侵染豇豆的報道．

在本研究中，疑似病原菌的鑒定采用了形態特征結合rDNA-ITS序列分析的分子方法，彌補了形態特征無法有效鑒定鐮孢菌屬內種的缺陷．但也有人發現，鐮孢菌各種的rDNA-ITS序列相對保守，差異變異區域較少，無法準確區分鐮孢菌各種及復合種[23-25]，因此，未來對于鐮孢菌種，特別是復合種的鑒定工作需要補充其他的核酸序列，如翻譯延伸因子基因EF1-α和RNA聚合酶Ⅱ基因RPB2[26]．同時，前人研究發現鐮孢菌屬多種鐮孢菌都能產生色素，且色素顏色多變，甚至同種鐮孢菌能產生多種色素[27-30]，如Menezes等[27]報道茄腐鐮孢菌BRM054066菌株能夠產生紅色素，Zheng等[28]報道暗培養下茄腐鐮孢菌產生橄欖綠色素．鑒于此，本研究以鐮孢菌產生的色素顏色作為培養的主要指標，結果發現，茄腐鐮孢菌產生淡黃色色素，尖鐮孢菌觀察到的色素達12種，表明色素不能作為鐮孢菌分類的依據．

綜上，本文研究厘清了造成成都地區豇豆根腐病的病原，特別是崇州地區的豇豆根腐病原種類的多樣性，為豇豆的抗根腐病提供了依據．為了更好地防治豇豆根腐病，應該針對不同地區不同病原菌種群制定科學的防治策略，合理選用抗病品種，提高田間管理水平，盡可能采用生物防治方法實現對豇豆根腐病的綜合防治．