儲糧害蟲低氧應(yīng)答機制的研究進展

崔素芬 魯玉杰 劉志誠 邱江平

(江蘇科技大學糧食學院1，鎮(zhèn)江 212100)(上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院2，上海 200240)

氧氣是好氧生物利用有氧呼吸產(chǎn)生ATP的必需物質(zhì)。當氧氣不足時，呼吸代謝被抑制，ATP產(chǎn)量減少，活性分子增多，引起機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使組織損傷甚至死亡[1]。氣調(diào)儲糧技術(shù)即是利用這個原理，在密閉倉儲環(huán)境中隔絕外界O2或者人工充入N2或CO2降低O2比例，達到害蟲防治、綠色儲糧的目的[2]。氣調(diào)儲糧是我國未來生態(tài)儲糧的重要方式之一，目前已在綿陽、南京、上海、九江、蘇州等糧庫推廣應(yīng)用[3]。

然而，經(jīng)過長期進化，昆蟲形成了較強的低氧抗性，給這項技術(shù)帶來挑戰(zhàn)。現(xiàn)實證明，一些鞘翅目、鱗翅目、直翅目、雙翅目、等翅目昆蟲等可以從數(shù)小時甚至數(shù)天缺氧中恢復[4-7]。在氣調(diào)儲糧時，將氧氣體積分數(shù)降至2%～5%、維持2～3個月可以有效地控制害蟲發(fā)展，當氧氣濃度恢復時，害蟲可能再次爆發(fā)[8-10]。這種能力在哺乳動物中罕見。因此，揭示昆蟲低氧適應(yīng)機制，有助于推動氣調(diào)儲糧技術(shù)廣泛應(yīng)用、構(gòu)建新型害蟲防治策略。現(xiàn)對儲糧害蟲低氧適應(yīng)策略及相關(guān)機制進行綜述。

1 儲糧害蟲低氧應(yīng)答策略

生物通過行為趨避、組織改變、代謝重構(gòu)、基因調(diào)控、遺傳變異等策略，形成了較強的低氧適應(yīng)性。

1.1 昆蟲改變生物學行為適應(yīng)低氧脅迫

當短時間低氧處理時，昆蟲及時調(diào)節(jié)氣孔開閉、增加腹部蠕動以暫時獲取外部氧氣；當仍不能滿足氧氣需求時，昆蟲抑制覓食、生長發(fā)育、繁殖行為，降低ATP所需，降低組織過氧化性損傷。另外，昆蟲可以調(diào)整食物結(jié)構(gòu)，提高能源物質(zhì)攝入比例，減少不必要的能量消耗。例如，四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)、綠豆象(Callosobruchuschinensis)、粉斑螟(Ephestiacautella)等昆蟲被低氧處理后生長發(fā)育減緩或停止，繁殖能力下降，但是子代孵化率卻提高[11-14]。這表明，氣調(diào)儲糧時，需將糧倉內(nèi)氧氣降至極低，且維持足夠長時間才可充分抑制害蟲種群繁衍。

1.2 昆蟲改變組織形態(tài)適應(yīng)低氧脅迫

當長時間低氧處理時，昆蟲通過改變細胞、體型體積大小，氣管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)等補償性策略來提高抗低氧脅迫能力[15,16]。當一些非脊椎動物或靠體表呼吸的脊椎動物體型增大，氣體交換效應(yīng)減弱。因此，低氧耐受型赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)等昆蟲體型減小，有利于提高氣體交換效應(yīng)即氧氣利用率[17,18]。

隨著形態(tài)學表征設(shè)備及技術(shù)提升，昆蟲體型大小、氣管結(jié)構(gòu)等表型變化被直觀地體現(xiàn)。例如，利用 X線源相位對比技術(shù)，發(fā)現(xiàn)體型較大的昆蟲將身體大部分用于氣管系統(tǒng)，表明氣管投入與昆蟲體型大小成正相關(guān)[19]。低氧條件下，昆蟲氣管系統(tǒng)內(nèi)大型多細胞傳導氣管(直徑<2 mm)和微小型氣管(直徑>90 nm)結(jié)構(gòu)變化情況被逐步揭示。例如，利用同步輻射計算機斷層掃描技術(shù)(SR-μCT)、共焦顯微鏡分析，發(fā)現(xiàn)果蠅飛行肌內(nèi)氣管形態(tài)補償變化主要發(fā)生在小的、遠端氣管和微氣管，而那些主分支和次分支氣管變化不明顯。此時，這些氣管直徑變大、分支增多，線粒體內(nèi)氣管投入增加、氣管容積比增大，增加氧氣供應(yīng)、減小ATP損耗，提高昆蟲低氧適應(yīng)性[16,20]。昆蟲氣管分支過程具有高度可控性和保守性。某些糖基水解酶、disc生長因子等在果蠅氣管幾丁質(zhì)-角質(zhì)層合成與分解、維持管道功能穩(wěn)定過程起關(guān)鍵作用[21]。因此，深入分析這些因子對氣管組分影響，將有助于揭示低氧條件下昆蟲氣管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和可塑性機制。

1.3 昆蟲調(diào)整分子代謝適應(yīng)低氧脅迫

生物表型發(fā)生變化時，必然伴隨著一系列分子代謝水平的變化。近年來， “組學”技術(shù)的發(fā)展為揭示一些非模式種如儲糧害蟲低氧適應(yīng)機制提供了便利。在低氧條件下，有氧代謝被抑制，厭氧代謝被激活，供應(yīng)ATP和能量，同時生成大量的代謝產(chǎn)物。其中，一些物質(zhì)如乳酸、丙氨酸、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙醇、檸檬酸、醋酸鹽、甘油-3 磷酸鹽等易對昆蟲造成過氧化性損傷；而一些物質(zhì)如肌醇、山梨糖醇、亞油酸、絡(luò)氨酸、色氨酸、脯氨酸、谷氨酸、4-氨基丁酸、甘油、甘露糖、木糖醇等可能有利于昆蟲適應(yīng)低氧環(huán)境[12,22]。此時，葡萄糖的利用率提高，每分子葡萄糖生成ATP增多、電子減少[23]。

昆蟲發(fā)育階段不同，分子代謝響應(yīng)機制有可能不同。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，果蠅成蟲體內(nèi)木糖醇、甘露糖醇、甘氨酸、牛磺酸等保護性物質(zhì)的含量明顯增加；而幼蟲體內(nèi)甘露糖、木糖醇、甘油、絲氨酸、絡(luò)氨酸等物質(zhì)明顯減少[24]。這說明，昆蟲根據(jù)需求來調(diào)控最初代謝方向、增強環(huán)境適應(yīng)能力。成蟲階段側(cè)重于增加保護性物質(zhì)、提高免疫防御能力，而幼蟲階段更傾向于增加能量、抗氧化代謝、與變性蛋白綁定等相關(guān)物質(zhì)，為后續(xù)生存、發(fā)育做準備。

一些關(guān)鍵的代謝物功能及調(diào)控機制正在逐步被揭示。研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸鹽的累積，除了帶來組織缺血再灌注性損傷以外，激活低氧誘導因子(Hypoxia inducible factors，HIFs)信號途徑，誘導氣管重塑，使昆蟲在低氧條件下生存幾天甚至幾周時間[25]。因此，琥珀酸脫氫酶變化也會影響抗低氧脅迫過程。例如，低氧耐受型果蠅線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶活性降低，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)量降低，且伴隨著復合物Ⅰ和Ⅲ活性提高、復合物Ⅱ活性降低等生理現(xiàn)象[26]。琥珀酸脫氫酶等位基因調(diào)節(jié)昆蟲代謝率變化、HIF信號途徑激活，影響氣管發(fā)育、氧氣輸送、生存狀況以及種群繁衍等生物過程[27]。除琥珀酸以外，其他代謝產(chǎn)物如ROS、α-酮戊二酸等對生物低氧適應(yīng)性的調(diào)控機制正被逐漸揭示[28]。

1.4 昆蟲改變基因表達模式適應(yīng)低氧脅迫

當代謝水平發(fā)生改變時，往往伴隨著轉(zhuǎn)錄水平改變。大量研究表明，昆蟲體內(nèi)大部分糖酵解基因表達量上調(diào)，線粒體代謝被抑制，一個轉(zhuǎn)錄因子hairy被誘導產(chǎn)生，抑制下游三羧酸循環(huán)(TCA)代謝通路的基因表達；一些關(guān)鍵消化酶編碼基因及其酶活性降低。涉及Notch、Toll/Imd、表皮生長因子(EGF)、胰島素受體、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信號途徑的基因表達量上調(diào)或被誘導產(chǎn)生，相關(guān)信號通路及效應(yīng)分子被激活[5,18,29,30]。這些信號途徑的激活、細胞呼吸蛋白調(diào)控、代謝酶多態(tài)性差異性變化等，不僅對提高昆蟲低氧適應(yīng)能力至關(guān)重要，可能在保護哺乳動物免受低氧損傷方面也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

基因表達模式往往隨著物種、齡期和處理方式改變。例如，經(jīng)低氧篩選獲的低氧耐受型果蠅在成蟲、幼蟲基因變化情況差異明顯，其中，幼蟲體內(nèi)差異基因(DEGs)比成蟲DEGs多；僅有少量DEGs同時出現(xiàn)在成蟲和幼蟲體內(nèi)，大部分上調(diào)基因涉及免疫蛋白，下調(diào)基因涉及代謝酶類[18]。這也解釋了“成蟲與幼蟲在低氧響應(yīng)時代謝傾向的不同”。同樣，在不同處理方式如連續(xù)低氧(CH)和間歇低氧(IH)，昆蟲基因數(shù)目和種類也存在明顯差異[31]。基因表達也受物種影響。上述研究也表明，赤擬谷盜、四紋豆象、綠豆象等低氧響應(yīng)不同，基因表達模式也存在差異。在低氧條件下，綠豆象體內(nèi)涉及TCA循環(huán)大部分基因表達量增加，這與滯育果蠅情況相似，與四紋豆象情況相反[32]。

目前，一些低氧響應(yīng)基因如呼吸蛋白、線粒體氧化酶c、熱激蛋白、TCA循環(huán)相關(guān)酶、鐵氧還原蛋白等變化對生物低氧適應(yīng)性有影響，具體功能正在不斷揭示中。例如，呼吸蛋白(Glob)被認為與氧氣供應(yīng)有關(guān)。低氧時，Glob在大多數(shù)脊椎動物和水生生物如搖蚊(Chironomusspp)表達量增加；而果蠅Glob1基因表達量卻降低，在恢復常氧時表達量升高[33]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，Glob與卵細胞形成有關(guān)，并且可能受HIF調(diào)控，但是具體功能及調(diào)控機制仍不清。基于“組學”研究思路，利用已獲得低氧響應(yīng)基因或代謝物，通過構(gòu)建共表達分析，可以快速獲得關(guān)鍵調(diào)控因子即未來新型防治策略靶標位點，進一步揭示該調(diào)控因子的作用機制。

2 低氧應(yīng)答調(diào)控機制

目前，關(guān)于昆蟲低氧抗性機制的研究多以模式生物為對象，針對非模式類儲糧害蟲的相關(guān)研究較少。無論脊椎或非脊椎動物的生長發(fā)育過程具有高度保守性和可塑性。因此，大量關(guān)于模式生物的相關(guān)研究必將為揭示儲糧害蟲低氧應(yīng)答調(diào)控機制提供基礎(chǔ)和參考。將昆蟲低氧應(yīng)答調(diào)控模式分為兩大類：HIF依賴型和非HIF依賴型調(diào)控模式。

2.1 HIF依賴型調(diào)控模式

近30年來，HIF一直被認為是生物低氧轉(zhuǎn)錄應(yīng)答響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。HIFs是一系列具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋/時鐘-芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子-專一性蛋白結(jié)構(gòu)域(bHLH/PAS)結(jié)構(gòu)的蛋白，由α和β亞基構(gòu)成，具有高度保守性。果蠅與哺乳動物HIFα和HIFβ同源的基因分別是sima和tango，在線蟲(Caenorhabditiselegans)體內(nèi)分別是hif-1和aha-1。常氧時，HIFα亞基在脯氨酰羥化酶(PHD)和天冬氨酰羥化酶(FIH)作用下發(fā)生羥基化后，迅速與希佩爾-林道蛋白(VHL)結(jié)合而降解。低氧時，HIFα增加，轉(zhuǎn)運至細胞核與HIFβ形成異源二聚體(HIFα/ARNT)后，與低氧響應(yīng)元件(Hypoxia responsive elements, HREs)綁定、誘導下游靶標基因表達，調(diào)控生長發(fā)育、新陳代謝、血紅蛋白合成、氣管重塑等[34,35](見圖1)。

圖1 HIF信號途徑調(diào)控模式

除了HREs以外，低氧響應(yīng)基因序列中還存在其他順式作用元件，協(xié)同調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄起始和效率。例如，除HREs以外，四紋豆象HSP27、HSP21基因序列還存在熱休克元件(HSES)、CREB、GATA2、TATA等其他順式元件，它們與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控HSP表達，如HSP啟動子序列中HSEs與熱休克轉(zhuǎn)錄因子HREs與HIF結(jié)合等共同誘導HSP表達，提高四紋豆象低氧適應(yīng)能力[5]。這些順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合效應(yīng)，影響HIF在低氧響應(yīng)基因表達與調(diào)控過程中的功能。隨著研究深入，越來越多低氧響應(yīng)基因被發(fā)現(xiàn)與HIF功能相關(guān)，這些基因序列結(jié)構(gòu)、功能逐漸被揭示。例如，組蛋白脫甲基酶-2(KDM2)，一類人類癌癥中的解除管制因子，在果蠅、人類細胞中廣泛存在。研究證實，低氧時，KDM2啟動子與HIF1綁定后，共同參與調(diào)控果蠅低氧適應(yīng)過程、人類癌癥細胞發(fā)育過程等[36]。

HIF發(fā)揮功能取決于HIF1α亞基與VHL蛋白綁定過程，與氧感受器(PHD和FIH)活性密切相關(guān)。在低氧條件下，PHD催化脯氨酰基(Pro402和Pro564)，F(xiàn)IH天冬氨酰基(Asn803)發(fā)生羥基化反應(yīng)。已知PHD和FIH活性受到多種因子影響(見圖2)。一些因子發(fā)揮正調(diào)控作用，如O2、Fe、VC等增加PHD2活性，降低HIF1α穩(wěn)定性；一些因子發(fā)揮負調(diào)控作用，如ROS、NO等抑制PHD2活性，提高降低HIF1α穩(wěn)定性，而PHD2是HIF1α負調(diào)控因子[18,34,37]。

注：“+”表示正調(diào)控，“-”表示負調(diào)控。圖2 生物體內(nèi)各因子對HIF功能調(diào)控關(guān)系圖[35]

大部分調(diào)控因子的產(chǎn)生與線粒體功能有關(guān)。線粒體是重要氧氣感受器，對生物低氧響應(yīng)起著觸發(fā)器的作用。低氧時，線粒體內(nèi)代謝發(fā)生重構(gòu)，氧化還原電位發(fā)生改變，調(diào)控胞質(zhì)信號通路以防御低氧應(yīng)激損傷。線粒體呼吸電子傳遞鏈(ETC)構(gòu)成部分如細胞色素C復合物Ⅲ、復合物Ⅰ，Reike-iron硫蛋白、線粒體DNA、ATP合酶活性抑制因子1(ATPIF1)等，有助于HIF蛋白穩(wěn)定；線粒體內(nèi)氧化還原電位、Fe2+、O2、代謝產(chǎn)物如TCA代謝產(chǎn)物、ROS、NO、VC、等，調(diào)控PHD活性，調(diào)控細胞內(nèi)信號通路適應(yīng)低氧脅迫[38]。這些因子的調(diào)控功能正逐步被研究。例如，在線粒體內(nèi)，谷胱甘酸在谷氨酰胺酶作用下生成后，進入TCA循環(huán)，通過α-酮戊二酸轉(zhuǎn)換成琥珀酸，脂多糖(TLPs)累積，從而激活HIF功能[39]；TCA代謝產(chǎn)物檸檬酸鹽被輸送至細胞核生成胞質(zhì)乙酰輔酶A，調(diào)控蛋白乙酰化，引起細胞信號通路核及表觀遺傳狀態(tài)[40]；線粒體代謝生成ROS，通過氧化信號蛋白結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基硫醇基團，調(diào)控細胞增殖、分化以及低氧脅迫[29]。

另外，一些調(diào)控因子屬于多蛋白復合物Branma/SWI/SNF、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/雷帕霉素信號靶點(TOR)、真核起始因子2(elF2)和真核翻譯延伸因子2(eEF2)等，在HIF功能調(diào)控過程發(fā)揮重要的作用[41]。可見，HIF功能受多個不同因子協(xié)同調(diào)控。例如，sima和tango是果蠅HIF重要的調(diào)控因子，當敲除sima和tango功能時，F(xiàn)atiga和IDH表達量明顯下降[42]。Fatiga是PHD氧受體之一，它通過調(diào)控HIF/Sima功能，影響昆蟲生長發(fā)育過程。當Fatiga缺失時，果蠅蛹、細胞體積變小；當Fatiga過表達時，果蠅成蟲翅膀細胞體積增大；當fatiga和sima基因同時過表達時，蛹的體積不變；另外，當fatiga過表達時，果蠅成蟲過度生長，但是HIFs蛋白表達量卻無顯著提高[43]。據(jù)猜測，fatiga可能通過一種不依賴于Sima/Tango信號途徑調(diào)控生長發(fā)育，但是具體調(diào)控模式仍未知。

2.2 非HIF依賴型調(diào)控模式

盡管HIF1激活作用具有一定的共性，但不同生物體的低氧耐性卻有很大差異。在低氧條件下，大部分低氧敏感性高的生物試圖補償ATP需求，而耐低氧的生物則減少ATP的供應(yīng)和消耗[44-46]。這表明，除了HIF1以外，其他調(diào)控因子也參與了生物低氧適應(yīng)過程。野生型與HIF1缺失型線蟲mRNA低氧應(yīng)答情況相比基因表達量變化明顯[47]；昆蟲熱激蛋白被誘導產(chǎn)生需HIF1，而氣管末端向氧氣匱乏區(qū)補償發(fā)育則需HIF1和不依賴HIF1的組分協(xié)同作用等，進一步驗證了HIF1并不是唯一的低氧應(yīng)答調(diào)控途徑[5,48,49]。在低氧條件下，NO/cGMP/PKG信號途徑被激活，通過誘導下游線粒體ATP敏感型鉀離子通道(KATP)，啟動細胞適應(yīng)性保護機制，降低昆蟲細胞死亡率[50]；轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)被誘導產(chǎn)生，調(diào)控下游葡萄糖代謝影響昆蟲低氧抗性；先天免疫轉(zhuǎn)錄因子NF-kappa B/Relish(FOXO靶標因子)及下游靶標基因被誘導產(chǎn)生；FOXO、Relish編碼基因被敲除時，昆蟲死亡率提高[51]；當TORC1途徑受抑制，脂肪體內(nèi)脂質(zhì)代謝受干擾，昆蟲生長發(fā)育減緩[5]； Wnt途徑被激活時，低氧耐受型果蠅成蟲羽化率提高；在腫瘤細胞里Wnt途徑也被激活[52]。Warts是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有抑制細胞生長調(diào)控功能，當Warts基因功能缺失、胰島素受體基因過表達時，氣管重塑加劇、氧氣供應(yīng)量增加，低氧耐受性增強[15]。研究表明，除上述因子以外，Toll、JNK、Notch、胰島素受體、絡(luò)氨酸受體等參與了昆蟲低氧適應(yīng)過程，具體調(diào)控機制正在研究中[18,53-55]。

2.3 其他

除了與HREs綁定以外，HIF與其他轉(zhuǎn)錄因子，共同調(diào)控生物低氧適應(yīng)過程。例如，激活AKT-mTOR-HIF1α信號途徑，有助于增強細胞內(nèi)糖酵解反應(yīng)過程[56]。將埃及伊蚊(Aedesaegypti)腸道感染大腸桿菌后發(fā)現(xiàn)，組織內(nèi)HIFα增加，HIF信號途徑啟動，同時下游胰島素/胰島素類生長因子(IGF-1)被激活，腺苷單磷酸激酶(AMPK)信號途徑被抑制，協(xié)同調(diào)控幼蟲生長與代謝過程[36]。HIF與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、調(diào)控靶標基因表達的過程受磷酸化和亞硝基化水平影響[57]。隨著“組學”、分子生物技術(shù)發(fā)展，昆蟲低氧應(yīng)答調(diào)控過程將被逐步揭示。

3 總結(jié)與展望

盡管氣調(diào)儲糧技術(shù)可以有效抑制害蟲種群發(fā)展，然而儲糧害蟲較強的低氧適應(yīng)能力給這項技術(shù)實質(zhì)應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)。在長期密閉環(huán)境中，儲糧害蟲形成了一系列策略如改變生物學行為特征、組織結(jié)構(gòu)、代謝與轉(zhuǎn)錄水平等來適應(yīng)低氧脅迫。在這個過程中，多種信號轉(zhuǎn)導因子參與并發(fā)揮了重要調(diào)控功能。其中，低氧誘導因子(HIF)在誘導低氧響應(yīng)基因表達，調(diào)控昆蟲生長發(fā)育、免疫、氣管重塑等過程發(fā)揮了關(guān)鍵作用。除HIF以外，Toll、NF-κB/、JNK、Notch、腫瘤抑制蛋白、SP因子、NO/cGMP/PKG、mTOR、Wart、FOXO等因子也發(fā)揮了重要的作用。這些調(diào)控因子彼此影響，共同參與調(diào)控昆蟲低氧適應(yīng)過程。

目前，國際上關(guān)于昆蟲低氧適應(yīng)性機制的研究多以模式生物如果蠅為對象，而以非模式類儲糧害蟲為研究對象的罕見。盡管它們會共享一些保守途徑，但是不同的生活方式、種類的昆蟲低氧響應(yīng)過程也存在不同。轉(zhuǎn)錄組學分析表明，赤擬谷盜、四紋豆象、綠豆象等儲糧害蟲低氧適應(yīng)時，基因表達模式與果蠅存在明顯差異。通過篩選關(guān)鍵調(diào)控因子或關(guān)鍵靶標基因，分析相關(guān)調(diào)控途徑，進一步揭示儲糧害蟲低氧適應(yīng)性機制、彌補昆蟲低氧抗性研究的不足，為構(gòu)建新型害蟲防治策略甚至人類癌癥治療提供有效靶標提供依據(jù)和參考。