現代無損檢測技術在農產品真菌與真菌毒素侵染中的應用

穆渴心 蔡 俊 劉 棗 張 佳

(湖北工業大學，武漢 430070)

真菌可侵染多種初級農產品，不僅影響人畜健康，同時可造成大量經濟損失。真菌毒素是一類由真菌在生長繁殖過程中產生的次生有毒代謝產物，具有較強的穩定性，易進入食物鏈，造成人畜患病甚至死亡[1-3]。基于真菌與真菌毒素特性及其在農副產品中廣泛分布的特點，目前已經開發了薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)[4]、高效液相色譜-串聯質譜(High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry，HPLC-MS)[5，6]、液相色譜-串聯質譜(Liquid Chromatography Mass Spectrometry，LC-MS)[7]、酶聯免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)[8]、膠體金免疫技術(Colloidal Gold Immunochromatography)[9]等多種分析方法用于食品和農產品中真菌與真菌毒素的測定[10]。HPLC-MS、LC-MS、TLC等理化方法的結果準確、靈敏，但通常耗時長、破壞性大，不適合在線應用。ELISA、膠體金技術等屬于免疫學方法，特異性較強。但ELISA操作步驟繁瑣、對檢測人員的技術要求較高。膠體金技術其膠體溶液的穩定性較差、存放時間相對較短及靈敏度受到多種因素的影響。近年來，隨著多種現代無損檢測技術的發展，在真菌與真菌毒素領域，已有近紅外光譜(Near-infrared spectroscopy，NIRS)和中紅外光譜(Mid-infrared spectroscopy，MIRS)、電子鼻(Electronical nose，EN)、高光譜成像(Hyperspectral imaging，HSI)、熒光光譜法(Fluorescence spectroscopy，FS)和太赫茲時域光譜(THz time-domain spectroscopy，THz-TDS)應用于不同的農產品中真菌和真菌毒素的檢測研究，本文綜述了不同分析方法與化學計量學算法的結合應用，并討論了無損檢測技術結合化學計量學方法檢測真菌毒素技術的未來趨勢和挑戰。

1 真菌及真菌毒素

農產品易被曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)和鏈格孢屬(Alternaria)侵染。產生的真菌毒素包括黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFs)、赭曲霉毒素 (Ochratoxin)、赭曲霉毒素包含OTA、OTB、OTC、展青霉素(Patulin，PAT)和鐮刀菌屬毒素(Fusarium toxins)，鐮刀菌屬毒素包括單端孢霉烯族化合物(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON、雪腐鐮刀菌醇、3-乙酰-DON、15-乙酰-DON、T-2和HT-2毒素以及其他化學相關化合物)、伏馬菌素(Fumonisins，FB)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZON)和玉米赤霉烯酮衍生物(Zearalenone derivatives，ZONs)等，目前共發現真菌毒素400余種[11]。

其中，AFB1已被國際癌癥研究機構列為第1類致癌物。黃曲霉毒素可造成機體肝臟和膽囊癌變、致畸、致突變；OTA和橘霉素可造成腎臟病變；DON和PAT可造成胃腸道病變；FB和鏈格孢菌毒素可引起人體食道癌[12，13]。農副產品中真菌和真菌毒素的分布不均勻，且難以從糧食等農副產品中分離[14]，增加了檢測難度，因而需要無損、快速的檢測手段。

2 快速無損檢測方法

2.1 近紅外光譜(NIRS)和中紅外光譜(MIRS)

作為農副產品理化性質檢測技術，NIRS和MIRS以其高效的優勢逐步成為廣泛應用于產毒真菌和真菌毒素快速無損檢測的手段[15]。Tripathi等[16]采用偏最小二乘回歸模型對含AFB1(15～500 μg/kg)的紅辣椒粉漫反射率數據進行了定量檢測，驗證了MIRS檢測AFB1含量的可行性。Moscetti等[17]將板栗3個不同部位的漫反射光譜數據融合，將重度霉變、中度霉變、對照組完全分開，分類準確度高達97%。Durmus等[18]為鑒別黑曲霉侵染的無花果，采用NIRS成功區分出侵染與未侵染的無花果，并發現200～1 100 nm含有特征信息較多。Zheng等[19]發現，黃曲霉毒素產生的前體物質為雜色曲菌素，通過對雜色曲菌素的檢測，可以預警黃曲霉毒素的產生，其定量模型采用極端梯度提升算法，均方根誤差為3.57 μg/kg。

波長篩選是常用的提高檢測效率的方法。Teean等[20]以1 120、1 300和1 650 nm作為特征波長對感染不同時間黃曲霉的水果進行了分類，得到91%～100%不等的分類精度，發現二次判別分析分類精度高于線性判別分析。Williams等[21]利用NIRS收集被真菌侵染的玉米粒光譜數據，選取1 405 nm(淀粉的特征吸收)、1 660 nm(芳香結構的特征吸收)、1 900 nm(淀粉的特征吸收)、2 136 nm(蛋白質的特征吸收)作為特征波長進行PLS分析，在包含時間變量的模型中發現玉米粒腐敗程度與侵染時間存在正相關關系，R2為0.98。

NIRS和MIRS可以采用透射、漫透射、漫反射等各種光譜測量方式，反射光譜可以收集被侵染的農產品的表面信息，透射光譜則可以獲得樣品的內部特征信息[22]。建模方法中，已經普遍認為非線性方法比線性方法具有更強的模型適應能力。同時，運用合適的波長選擇算法，如競爭性自適應重加權、隨機森林、連續投影算法等[23]可篩選出含有特異性信息較多的波長，對復雜信息變量進行優化，簡化模型。

2.2 電子鼻(EN)

考慮到不同氣敏傳感器的特異性，采用多特征融合表征的模型構建方法，可以提高EN的預測能力[30-32]。郝銀鳳[33]研究了多特征組合表征測定AFB1、ZON、嘔吐毒素含量，結果顯示基于核變換 FDA的 BPNN誤差均小于 0.6%。

利用EN對真菌毒素直接進行分析的研究相對較少，目前EN主要用于產毒真菌的檢測，對真菌毒素含量較低的樣本進行定量時需要改良或優化儀器[34]。

2.3 高光譜成像(HSI)

HSI是集合了光譜與圖像的新型分析技術，能夠同時收集樣本的光譜和空間特性，獲得內外部的品質信息，因而可以用于檢測糧油中的真菌和真菌毒素[35]。

Kimuli等[36]采用VNIR-HSI收集了400～1 000 nm范圍內含AFB1為0.003 3～0.5 μg每粒的4個濃度梯度共600粒玉米粒的光譜，應用PCA進行數據降維，Fisher線性判別分析進行分類預測，準確率>96%。Kheiralipour等[37]利用NIR-HSI檢測開心果中的AFB1，發現QDA對不同菌種和不同時期的健康籽粒和感染籽粒的分類準確度更高。Barbedo等[38]將DON污染的小麥按照不同濃度分類，二分類準確率為81%，三分類準確率為72%。Chu等[39]采用短波紅外高光譜成像技術對玉米中AFB1濃度<20 μg/L、20～100 μg/L、≥ 100 μg/L進行了檢測。選取1 317、1 459、1 865、1 934、2 274 nm作為特征波長進行模型簡化，支持向量機準確率為82.5%，R2=0.70。

HSI相較二維光譜技術可獲取更多有效信息，但由于HSI屬于3-D “數據立方體”[40]，其中包含了大量冗余數據，因而在應用時需挖掘有效信息。此外，HSI不適用于液體或均質樣品，因為高光譜的成像功能旨在可視化空間異質性[41]。

2.4 熒光光譜法(FS)

FS是一種利用物質熒光性質進行無損檢測的方法。激光誘導熒光(LIFS)、單光子誘導熒光在真菌毒素檢測中應用較廣泛[42]。AFB和AFG在受到紫外線照射時會產生青黃色熒光(Bright Greenish Yellow Fluorescence，BGYF)，這使得FS分析黃曲霉毒素的侵染成為可能[43]。Smeesters等[44]應用單光子誘導熒光和雙光子誘導熒光光譜對AFB1侵染的玉米進行了檢測，發現在365、 405、 730、 750、 780、810 nm波長下，被侵染的玉米和未被侵染的玉米均存在光譜差異，其中，365 和780 nm波長下的光譜差異最大。Yao等[45]利用FS對AFB1污染的玉米粒進行檢測，采用兩種分類算法(最大似然法和二進制編碼法)，將玉米粒分為“對照組”和“污染組”。準確率分別為87%和88%。Davis等[46]應用FS對AFB1含量<15 μg/kg與AFB1含量>15 μg/kg的花生樣本建立模型，識別準確率超過80%。Smeesters等[47]發現熒光光譜下，AFB1含量<1 μg/kg與AFB1含量>70 μg/kg的玉米粒在400～550 nm內可完全分開。

LIFS已成功地用于農產品中痕量真菌毒素的測定。Wu等[48]采用LIFS對2種開心果中的AFB1進行了檢測。標準正態變換結合二階導數對混合樣品AFB1污染具有良好的判別能力(精度≥98.4%)。這些結果初步表明LIFS對人工污染AFB1的樣本進行篩選是可行的，但對天然污染樣品的性能還需要進一步的研究。

學者已經驗證了LIFS檢測AFB1的可行性，但仍然存在一些問題。首先，目前只進行了自建LIFS系統的靜態實驗，無法滿足實際在線檢測分析的高通量要求[49]。其次，早期的研究主要集中在單一探測器的LIFS，一個激光探頭和一個探測探頭，很難收集樣本的全部信息。此外，由于樣品本身表面不均勻所產生的散射效應，單個探測探針無法獲得完整的熒光信號。近年來，有學者采用高性能相機結合雙重紫外線激發光源收集玉米樣品的熒光圖像，單波段熒光數據(436 nm和532 nm)結合圖像數據用于分析樣本中黃曲霉毒素，實現了高速、大批量篩選，并獲得了較高精度的檢測結果[50]。為增強熒光信號，有學者嘗試增加生物傳感器或對待測物進行富集等方法，均獲得了較好的實驗結果[51]。

2.5 太赫茲時域光譜(THz-TDS)

太赫茲波是0.1～10 THz的電磁波，對應輻射頻帶范圍為30～3 000 μm。THz波介于微波與紅外輻射之間，相比短波的紅外光，太赫茲波具有更高的穿透性[52]。太赫茲輻射的光子能量較低(1 THz的能量為4 meV)屬于非電離電磁波，非電離形式的THz波不會破壞活細胞的組織和生物分子結構，因而可應用于生物醫學[53]、包裝商品檢驗[54]、食品檢驗[55]、水污染檢測等領域[56]。

THz-TDS是最常用的太赫茲光譜技術[57]。Ge等[58]對乙腈溶液中AFB1進行了測定，采用線性(PLS、PCR)回歸模型和非線性(SVM、PCA-SVM)回歸模型，在0.4～1.6 THz的頻率范圍內，采用THz-TDS定量測定乙腈溶液中AFB1的濃度。結果表明，AB1濃度為1～50 μg/L時，非線性回歸模型優于線性回歸模型。Liu等[59]用太赫茲光譜法結合化學計量學測定大豆油中的AFB1，發現BPNN結合T-SNE 檢測結果最佳(R2=0.994 8， RMSEP=0.712 4 μg/kg)，對于AFB1質量濃度低于1 μg/kg的大豆油進行檢測的準確率高于90%。

作為基于光譜技術的新興檢測手段，太赫茲光譜技術有一定的應用限制。第一，太赫茲輻射與生物分子間具有一定的相互作用，可以從微觀水平上解釋生物分子對太赫茲波的吸收規律，但需要運用有效的數據分析方法降低信號噪聲，提高信噪比。第二，改進太赫茲光譜儀器的硬件設備，如超材料，可提高太赫茲光譜的應用范圍，增強儀器敏感性，提高分析準確率[60]。

3 總結與展望

現代無損檢測技術以近紅外光譜和中紅外光譜、電子鼻、高光譜成像為代表，通過采集樣本的光學、電學及聲學特性結合信息學方法，實現農產品中真菌生物量與真菌毒素侵染的準確、快速檢測，為農產品在線、實時、無損檢測提供研究基礎。

現代無損檢測技術的結果可靠性依賴于樣本數據庫的建立，受到采樣范圍、樣本狀態及待測物多樣性等因素的影響，然而，隨著化學計量學與計算機技術的發展，結合模型傳遞與信息融合技術，現代無損檢測技術在農產品真菌及真菌毒素侵染的定性與定量分析中的應用必將得到更廣泛的應用。