5種植物精油對玉米象的殺蟲活性研究

楊二妹 賈 浩 周晨霞 李慧靜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071000)

糧食是人類賴以生存的必需品，糧食安全成為首要問題。根據(jù)我國儲糧損失相關(guān)資料顯示，國家?guī)鞊p失為0.2%，農(nóng)戶儲糧損失為6%～9%[1]。玉米象在我國已被列入10大儲糧害蟲之中，也被視為世界頭號儲糧害蟲[2]。玉米象是蛀食性儲糧害蟲，主要發(fā)生在稻谷、小麥和玉米等原糧中，被害糧食幾乎為空殼，糧食的品質(zhì)嚴(yán)重下降和質(zhì)量減少[3, 4]。玉米象分布較為廣泛，在我國多個省的地方糧食儲備庫及加工企業(yè)和儲糧農(nóng)戶中均有玉米象的存在[5, 6]。玉米象屬于鞘翅目象甲科，善于爬行、能飛行、有假死性和喜潮濕、陰暗地等生物學(xué)特性[7]。在我國玉米象每年可發(fā)生1～7代，由北方到南方，隨著溫度和濕度的變化，東北每年產(chǎn)1～2代，廣東、廣西等地每年可產(chǎn)7代，由北向南產(chǎn)生的代數(shù)逐漸增多，對糧食危害很嚴(yán)重[8, 9]。

磷化氫被廣泛用于防治儲糧害蟲，是一種劇毒農(nóng)藥，長期使用儲糧害蟲產(chǎn)生抗藥性，并污染環(huán)境及危害工作人員的身體健康[10, 11]。植物源殺蟲劑是一種天然無害、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、殺蟲范圍廣且易得到的綠色安全的儲糧熏蒸劑[12, 13]。植物源殺蟲劑是直接利用或提取植物的根、莖、葉、花、果、種子等或利用其次生代謝物質(zhì)制成具有殺蟲作用的活性物質(zhì)[14, 15]。植物源殺蟲劑主要分為生物堿類、魚藤酮類、楝科植物、除蟲菊類、萜類化合物、植物光活化毒素和植物精油[16]。植物精油作為植物的次級代謝產(chǎn)物，具有特殊的芳香氣味、易揮發(fā)、溶于有機溶劑的復(fù)合化合物[17, 18]。

國外很多學(xué)者已對植物精油有大量的研究，Kim等[19]研究了10種植物精油對米象的熏蒸實驗，其中香菜精油(caraway), 小茴香精油(dill)，孜然精油(cumin)對米象的熏蒸效果較其他精油好，其半數(shù)致死劑量分別為2.45、3.29、4.75 mg/L。Hernandez-Lambrao等[20]研究表明香茅(Cymbopogon martinii)精油熏蒸24 h玉米象的致死率達(dá)90%以上，半數(shù)致死量為37.2 μL/L，比市售產(chǎn)品IR3535效果更好。近些年國內(nèi)外植物源農(nóng)藥得到長足發(fā)展。李慧等[21]研究表明改性大蒜素對糧堆表面上的玉米象具有很好的熏蒸效果，熏蒸24 h體積分?jǐn)?shù)為96 μL/L，玉米象的死亡率可達(dá)到100%。張超等[22]研究表明辣根素熏蒸玉米象72 h時具有較高的熏蒸活性，LD50為 0.74 μg/mL，LD90為1.53 μg/mL。本研究選取了生姜精油、羅勒精油、丁香精油、薄荷精油和黑胡椒精油，設(shè)置不同濃度、不同處理時間對玉米象的熏蒸實驗，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀對精油的成分進(jìn)行測定，旨在篩選出對控制儲糧害蟲玉米象效果較好的植物精油，為進(jìn)一步開發(fā)新型植物源殺蟲劑提供參考。

1 實驗材料和方法

1.1 材料與試劑

材料與試劑：生姜精油、羅勒精油、丁香精油、薄荷精油、黑胡椒精油、丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯、薄荷醇、檸檬烯、聚四氟乙烯、300 mL三角瓶、濾紙、封口膜、移液槍。

設(shè)備：電熱鼓風(fēng)干燥箱，恒溫培養(yǎng)箱，安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.2 玉米象飼養(yǎng)方法

玉米象蟲源：2019年2月由國家物資和儲備局引進(jìn)。

飼養(yǎng)方法：參照黃衍章等[23]、侯昌亮等[24]飼養(yǎng)玉米象的方法，將未接觸過農(nóng)藥的小麥粒去除雜質(zhì)和塵土，清洗后放入80 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)消毒2 h。將消毒好的小麥粒放置室溫后，含水量調(diào)至12.5%～14%。將養(yǎng)蟲瓶在121 ℃、15 min的條件下消毒，冷卻后在養(yǎng)蟲瓶2/3處涂一層聚四氟乙烯，防止成蟲爬出。用已消毒的毛筆將成蟲接入裝有1/3飼料的養(yǎng)蟲瓶中，用濾紙將瓶口封好，放入養(yǎng)蟲室內(nèi)(溫度：27～29 ℃，濕度：70%～80%。待下一代大量成蟲羽化后2周取出作為試蟲供實驗使用。

1.3 實驗方法

1.3.1 熏蒸實驗

參照程作慧等[25]、楊杉等[26]三角瓶濾紙密閉熏蒸法：將三角瓶置于滅菌鍋中121 ℃、15 min滅菌，冷卻后在距瓶口2～3 cm處均勻的涂一層聚四氟乙烯，防止試蟲爬出。每瓶接入玉米象成蟲20頭，用微量移液槍分別吸取不同劑量的精油，體積分?jǐn)?shù)分別為10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00、40.00 μL/L，分別滴于長方形濾紙片1×12 cm上，并迅速懸掛在距300 mL三角瓶底部2～3 cm處，濾紙片不能與瓶壁、瓶底接觸，迅速將瓶口密封。以空白濾紙作對照，每一個處理重復(fù)3次。置于溫度為27～29 ℃、濕度70%～80%的養(yǎng)蟲室中，分別于處理24、48、72、96 h時，觀察玉米象的死亡數(shù)，并計算校正死亡率。

參照上述方法用移液槍分別取丁香酚5、10、15、20、25、30 μL，體積分?jǐn)?shù)為12.50、25.00、37.50、50.00、62.50、75.00 μL/L，移取肉豆蔻酸異丙酯60、70、80、90、100、110 μL，體積分?jǐn)?shù)為150.00、175.00、200.00、225.00、250.00 μL/L，進(jìn)行玉米象熏蒸實驗，每一處理設(shè)置3個重復(fù)，置于養(yǎng)蟲室內(nèi)，分別在24、48、72、96 h觀察玉米象的死亡數(shù)，并計算校正死亡率。

死亡標(biāo)準(zhǔn)：以撥針觸及成蟲尾部、觸角及足不動者為死亡。

死亡率=死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100%

1.3.2 GC-MS精油成分分析

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀安捷倫氣相色譜7890A-質(zhì)譜5975C對精油成分進(jìn)行分析。

氣相色譜條件:色譜柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度280 ℃，程序升溫條件：初始溫度，60 ℃保持3 min，30 ℃/min到285 ℃保持9 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描范圍為全掃描，溶劑延遲2.9 min，使用NIST譜庫圖譜檢索進(jìn)行定性，采用面積歸一法進(jìn)行成分含量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 17.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理、方差分析，并使用該軟件中Probot回歸法進(jìn)行毒力分析(5%顯著水平)。運用Origin 9.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果分析

2.1 玉米象熏蒸結(jié)果及分析

在溫度27～29 ℃，濕度70%～80%的黑暗條件下進(jìn)行5種精油7個濃度梯度測定對玉米象熏蒸毒力的劑量效應(yīng)，每一濃度分別在24、48、72、96 h觀察一次，每個處理設(shè)3個重復(fù)，測定精油對玉米象熏蒸毒力的時間效應(yīng)。圖1表示5種精油不同濃度處理24、48、72、96 h對玉米象熏蒸毒力的測定結(jié)果。

從圖1可看出5種植物精油熏蒸玉米象24、48、72、96 h，校正死亡率均隨精油濃度增大呈上升趨勢，同種精油同一濃度隨時間的延長玉米象的校正死亡率增大。薄荷精油和羅勒精油熏蒸玉米象24、48、72 h的校正死亡率均有顯著差異，熏蒸96 h，7個濃度玉米象的校正死亡率基本達(dá)到100%，無顯著性差異，熏蒸效果較好。

熏蒸24 h，體積分?jǐn)?shù)為10 μL/L時，薄荷精油和羅勒精油的校正死亡率分別為25%、12.5%，體積分?jǐn)?shù)為40.00 μL/L時，薄荷精油和羅勒精油的校正死亡率分別為87.50%、45%以上。可見熏蒸24 h精油濃度對玉米象的校正死亡率影響較大。Buentello等[27]研究了羅勒精油對三種果蠅的熏蒸實驗，熏蒸2 h體積分?jǐn)?shù)為2.5%致死率均為77%以上，說明同種精油熏蒸不同種害蟲效果不同，羅勒精油對熏殺害蟲種類范圍較大。楊杉等[26]研究了8種植物精油對玉米象的熏蒸毒力，熏蒸24 h，薄荷精油對玉米象的熏蒸效果最強，校正死亡率為86.67%。熏蒸48 h，羅勒精油和薄荷精油的7個濃度熏蒸玉米象的校正死亡率均在60%以上，體積分?jǐn)?shù)為40 μL/L，校正死亡率均超過80%。熏蒸48 h，丁香精油和黑胡椒精油對玉米象的校正死亡率均未到達(dá)40%，丁香精油隨濃度增大，玉米象的校正死亡率逐漸升高，但校正死亡率相對較低。洪承昊[28]研究表明留蘭香精油熏蒸48 h、體積分?jǐn)?shù)為6.25 μL/cm3，玉米象的校正致死率為15.5%，體積分?jǐn)?shù)18.75 μL/cm3校正死亡率為97.7%，熏蒸72 h、體積分?jǐn)?shù)為2.257 μL/cm3，玉米象的校正死亡率為24.4%，體積分?jǐn)?shù)為18.757 μL/cm3，玉米象的校正死亡率為98.8%，隨濃度、時間不斷增大，玉米象校正死亡率明顯增加。熏蒸72 h，生姜精油的7個濃度對玉米象的校正死亡率均達(dá)到75%以上，羅勒精油和薄荷精油體積分?jǐn)?shù)在40.00 μL/L時，玉米象的校正死亡率達(dá)到100%。隨熏蒸時間延長，玉米象的校正死亡率不斷升高。熏蒸96 h，薄荷精油體積分?jǐn)?shù)為15 μL/L時，玉米象的校正死亡率達(dá)到100%，羅勒精油體積分?jǐn)?shù)為20.00 μL/L時，玉米象的校正死亡率達(dá)到100%，生姜精油體積分?jǐn)?shù)為25.00 μL/L時，玉米象的校正死亡率為100%。丁香精油體積分?jǐn)?shù)為40.00 μL/L 時，玉米象的校正死亡率達(dá)到90%，有顯著差異。黑胡椒精油熏蒸玉米象24 、48、72、96 h，7個濃度的校正死亡率規(guī)律性較差，殺蟲效果還需進(jìn)一步研究確定。說明薄荷精油對玉米象的熏蒸效果較好，羅勒精油對玉米象的效果僅次于薄荷精油。同一熏蒸時間不同種精油對玉米象的致死效果不同，說明精油熏蒸玉米象的有效成分含量不同、種類也不同，但隨精油劑量的不斷增大，玉米象的校正死亡率明顯增加，精油濃度對玉米象的校正死亡率影響較大。

注：同一圖中同一圖案上不同字母表示顯著差異，余同。圖1 5種精油不同濃度熏蒸24 h、48 h、72 h、96 h對玉米象的校正死亡率

綜合以上研究結(jié)果表明5種精油中薄荷精油對玉米象熏蒸效果最好，羅勒精油次之，丁香精油相對較差，若增大濃度熏蒸玉米象可能熏蒸效果會好。Gonzales等[29]研究了丁香精油和肉桂精油對玉米象的熏蒸效果，丁香精油熏蒸效果較差，在本研究中同一濃度丁香精油熏蒸玉米象的效果較其他精油差，說明丁香精油對玉米象的毒力較小。薄荷精油和羅勒精油熏蒸72 h和96 h時，玉米象的校正死亡率趨于100%，對玉米象的熏蒸效果較好。可為研制新型綠色植物源殺蟲劑提供參考，為進(jìn)一步說明薄荷精油和羅勒精油對玉米象的熏蒸效果，因此，對其進(jìn)行毒力回歸分析。

根據(jù)羅勒精油和薄荷精油對玉米象的熏蒸效果，計算出不同處理時間的回歸方程、致死中量及相關(guān)系數(shù)等。由表1可知薄荷精油熏蒸24 h的玉米象半數(shù)致死中量是72 h的3倍多。羅勒精油熏蒸24 h玉米象的半數(shù)致死中量(LD50)是72 h的8倍，與Hossain等[30]研究的羅勒精油對玉米象熏蒸48、72、96 h的半數(shù)致死中量為8.14、6.50、4.91 μL/mL，均表明隨熏蒸時間的延長、玉米象的半數(shù)致死中量逐漸減少，趨勢相一致。薄荷精油和羅勒精油對玉米象的毒力回歸方程中相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.90以上，說明兩種精油對玉米象毒力測定的回歸方程擬合程度較好，與實際情況相符合[31, 32]。周娟[33]研究結(jié)果表明肉桂精油對玉米象熏蒸24、48、72 h后，肉桂精油對玉米象的半數(shù)致死中量分別是1.97、1.54、1.12 μL/L。與本研究中的半數(shù)致死劑量隨熏蒸時間的延長，兩種精油處理玉米象的LD50值明顯下降有相同趨勢，與周娟的研究結(jié)果趨勢一致。

表1 羅勒精油和薄荷精油對玉米象的熏蒸毒力回歸分析

2.2 精油成分分析

為確定薄荷精油和羅勒精油中的有效成分，對兩種精油進(jìn)行氣質(zhì)分析。根據(jù)兩種精油的氣相色譜圖，可看出均存在多個峰，峰面積出現(xiàn)的時間和大小均不同，成分較為復(fù)雜。

從表2中可看出薄荷精油中的化學(xué)成分種類較多，分析出119種組分，其中10種化學(xué)成分含量達(dá)到81.6%。洪承昊[28]研究中發(fā)現(xiàn)薄荷精油的主要成分為薄荷醇和檸檬烯，薄荷醇含量較高，但不是薄荷精油中熏殺玉米象的有效成分，檸檬烯對玉米象有一定的熏殺效果，檸檬烯對玉米象處理體積分?jǐn)?shù)為37.5 μL/L時，熏蒸24、48、72 h 玉米象的校正死亡率分別為74.1%、87.5%、97.3%。本研究中選取薄荷醇和檸檬烯對玉米象進(jìn)行熏蒸實驗，確定對玉米象熏蒸的有效成分。

表2 薄荷精油的GC-MS分析

從表3中可以看出羅勒精油的化學(xué)成分種類較多，分離出70種組分，其10種化學(xué)成分含量達(dá)到96.48%，其中丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯、苯甲酸芐酯和石竹烯4種化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)91.4%。黃麗沄等[34]發(fā)現(xiàn)羅勒精油的成分丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.55%，石竹烯占4.73%，有很好的抑菌作用，說明有一定的毒殺效果。目前，研究羅勒精油所含的單體成分對玉米象的熏蒸效果的報道文獻(xiàn)較少，需進(jìn)一步研究確定有效成分。

表3 羅勒精油的GC-MS分析

從圖2可看出同一濃度檸檬烯、薄荷醇和丁香酚對玉米象的熏蒸活性隨時間的延長校正死亡率增加，同一熏蒸時間對玉米象的校正死亡率隨濃度增加而增加，且有顯著差異。在熏蒸96 h，檸檬烯體積分?jǐn)?shù)為75 μL/L對玉米象的校正死亡率95%以上，薄荷醇體積分?jǐn)?shù)為275 μL/L對玉米象的校正死亡率近90%，檸檬烯對玉米象的校正死亡率較薄荷醇較好。楊杉等[28]研究表明薄荷醇體積分?jǐn)?shù)為50 μL/L、對玉米象熏蒸24、48、96、120 h時，校正死亡率分別為0、2.5%、2.5%和12.9%，檸檬烯體積分?jǐn)?shù)為50 μL/L，對玉米象熏蒸24 h時，校正死亡率達(dá)到100%。薄荷精油的主要成分中檸檬烯對玉米象具有有效的熏殺效果，薄荷醇熏殺效果較弱。丁香酚體積分?jǐn)?shù)為75 μL/L時，熏蒸96 h玉米象的校正死亡率為100%。熏蒸時間對玉米象的校正死亡率有顯著影響。肉豆蔻酸異丙酯熏蒸24 h時，玉米象的校正死亡率為0，無熏蒸效果。熏蒸96 h時，玉米象的校正死亡率隨精油濃度的增大而增大，不同濃度下有顯著差異，體積分?jǐn)?shù)為275 μL/L時，校正死亡率為50%。丁香酚相對肉豆蔻酸異丙酯對玉米象的熏蒸效果較好，丁香酚是羅勒精油中主要殺蟲成分之一。薄荷精油和羅勒精油成分均較為復(fù)雜，其他成分對玉米象的熏殺效果還需進(jìn)一步分析。

圖2 檸檬烯、薄荷醇、丁香酚和肉豆蔻酸異丙酯對玉米象熏蒸24、48、72、96 h的校正死亡率

根據(jù)檸檬烯、薄荷醇和丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯對玉米象的熏蒸效果，分別計算出其不同處理時間的毒力回歸方程、致死中量及相關(guān)系數(shù)等。從表4可以看出檸檬烯熏蒸24 h的半數(shù)致死中量時96 h的4倍多，薄荷醇熏蒸24 h的半數(shù)致死中量是96 h的1.6倍，檸檬烯和薄荷醇對玉米象的半數(shù)致死中量隨時間的延長不斷減少。丁香酚熏蒸24 h時，玉米象的半數(shù)致死中量(LD50)是72 h的3倍多，熏蒸時間對熏蒸效果影響較大。肉豆蔻酸異丙酯熏蒸96 h時，玉米象的半數(shù)致死中量(LD50)為255.713 μL/L。四種成分對玉米象的毒力回歸方程中相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.90以上，說明對玉米象毒力測定的回歸方程擬合度較好，與實際情況相符合。薄荷精油中檸檬烯的半數(shù)致死中量較薄荷醇小，說明檸檬烯對玉米象的熏蒸毒性較薄荷醇大。羅勒精油的中的丁香酚的半數(shù)致死量較肉豆蔻酸異丙酯小，說明丁香酚對玉米象的熏蒸毒性較大。

表4 檸檬烯、薄荷醇和丁香酚、肉豆蔻酸異丙酯對玉米象的熏蒸毒力回歸分析

3 結(jié)論

在熏蒸24、48、72、96 h時，薄荷精油和羅勒精油對玉米象的熏蒸效果較好，兩種精油在熏蒸72、96 h，體積分?jǐn)?shù)為40.00 μL/L時，校正死亡率達(dá)到100%。羅勒精油熏蒸24、48、72 h時，LD50分別為44.569、 7.821、5.840 μL/L，薄荷精油熏蒸24、48、72 h時，LD50分別為18.124、 8.266、5.476 μL/L，相關(guān)系數(shù)(R2)均在90%以上，線性關(guān)系良好。采用氣相-色譜聯(lián)用儀對薄荷精油和羅勒精油分別進(jìn)行了成分分析，薄荷精油分析出119種成分，主要有薄荷醇(21.17%)、檸檬烯(12.59%)，檸檬烯較薄荷醇對玉米象具有較強的熏殺效果；羅勒精油分析出分離出70種成分，主要為丁香酚(38.55%)、肉豆蔻酸異丙酯(29.43%)，羅勒精油的主要成分丁香酚對玉米象的熏蒸效果較肉豆蔻酸異丙酯好，說明丁香酚為羅勒精油熏玉米象的有效成分之一，其他成分尚需進(jìn)一步研究確定。

綜合玉米象熏蒸實驗結(jié)果分析得出，薄荷精油對玉米象的熏殺效果最好，羅勒精油次之。因此，在防治儲糧害蟲方面比較有發(fā)展前景，可通過與其他精油進(jìn)行復(fù)配，研制出新型綠色、安全植物源殺蟲劑。