響應面優化超臨界CO2萃取韭菜子油工藝研究

林小華 葉惠嫻 徐巧鈺 許贊杉

(廈門醫學院藥學系1，廈門 361023)(廈門市中藥生物工程重點實驗室2，廈門 361023)

韭菜子是我國傳統中藥材之一，為百合科蔥屬植物韭菜的干燥成熟種子，具有溫補肝腎、壯陽固精的功效，主要用于治療肝腎虧虛、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、白濁帶下等多種病癥[1]。大量藥理研究表明韭菜子具有：改善性功能的作用、治療遺尿的作用、增強免疫的作用以及治療呃逆的作用等[2-6]。少量研究報導了韭菜子煙熏能治療牙痛的作用、韭菜子油具有抗高溫和抗低溫的作用以及韭菜子水提取物具有耐缺氧和抗疲勞作用[7-9]。目前對韭菜子油的提取研究主要采用水蒸氣蒸餾法[10]。與傳統的方法比較，超臨界 CO2萃取具有萃取率高、產品純度好、流程簡單、能耗低、無溶劑殘留，可減少萃取過程中不飽和脂肪酸的氧化，適合不穩定、易氧化的揮發性、脂溶性成分提取分離。本研究采用超臨界CO2萃取技術提取韭菜子油，在單因素實驗基礎上，借助實驗設計軟件 Design-Expert(V12)，采用Box-Behnken響應面法對影響韭菜子油萃取工藝條件進行優化，建立超臨界CO2萃取韭菜子油的數學模型，并采用GC-MS對韭菜子油的成分進行分析，以期為韭菜子油的充分利用和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

韭菜子：置于60 ℃烘箱中干燥后，粉碎并過40目篩備用；CO2氣體：純度>99.99%；乙醇：分析純。

1.2 儀器

PU-2086-CO2型超臨界萃取儀，Agilent7890B-7000B型氣相色譜-質譜/質譜聯用儀，RT-04型多功能粉碎機，BS224S型精密分析天平，DHG-9055A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 韭菜子油超臨界CO2提取工藝流程

韭菜子→烘干→粉碎→過篩(40目)→稱重→超臨界CO2萃取→分離→韭菜子油

1.3.2 單因素試驗設計

分別以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間為變量，以韭菜子油提取率為評價指標，進行單因素試驗，確定各影響因素的適宜范圍。1)萃取壓力對韭菜子油提取率的影響：選取萃取溫度40 ℃，分別在15、20、25、30、35 MPa萃取2.0 h，考察壓力對韭菜子油提取率的影響。2)萃取溫度對韭菜子油提取率的影響：選取萃取壓力25 MPa，分別在35、40、45、50、55、60 ℃萃取2.0 h，考察溫度對韭菜子油提取率的影響。3)萃取時間對韭菜子油提取率的影響：在萃取壓力25 MPa，萃取溫度55 ℃條件下，分別萃取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察萃取時間對韭菜子油提取率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選取萃取壓力、萃取溫度、萃取時間作為考察變量，以韭菜子油提取率為響應值，采用三因素三水平響應面分析法進行響應面分析，對韭菜子油萃取工藝進行優化。

1.3.4 甲酯化處理[11]

取韭菜子油0.5 g，置于10 mL具塞試管中，加入正己烷2 mL，0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL，搖勻，置70 ℃水浴中振搖10 min，冷卻，加水至10 mL，振搖提取，離心，取上清液加無水硫酸鈉脫水，進樣分析。

1.3.5 氣相-質譜分析條件

色譜條件：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度：250 ℃，程序升溫：初始溫度70 ℃,保持1 min,以5 ℃/min升溫至180 ℃,保持10 min,以1 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min；進樣量：1 μL，分流進樣，分流比20:1；載氣為He，載氣流速1.0 mL/min。

質譜條件:EI離子源，電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,質量掃描范圍50～500 amu。

1.3.6 定性定量分析

采用NIST14.L標準譜庫檢索和人工譜圖解析相結合的手段進行定性，并用氣相色譜峰面積歸一化法定量計算出各組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 韭菜子油超臨界CO2萃取工藝的優化

2.1.1 響應面法試驗設計

由單因素試驗可知，超臨界CO2萃取韭菜子油的較優壓力范圍為20～30 MPa，溫度范圍為50～60 ℃，提取時間范圍在1.5～2.5 h。在此基礎上，采用響應面分析法對韭菜子油提取工藝參數進行優化，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1，試驗結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表

表2 響應面試驗設計及結果

2.1.2 回歸方程的建立及顯著性檢驗

利用Design Expert 12.0軟件對表2實驗數據進行多元回歸擬合，得到韭菜子油萃取率Y對萃取溫度A、萃取壓力B、萃取時間C的二次多項回歸方程為:Y=40.608 88-0.516 75A-1.251 84B-0.248 287C+0.014 1AB+0.002 533AC-0.000 117BC+0.011 437B2+0.000 532C2。

為了檢驗回歸方程的可靠性并確定各因素對韭菜子油萃取率的影響程度，對回歸方程進行了方差分析，結果見表3。

表3 方差分析

由表3可以得知，回歸方程模型P值小于0.01，說明回歸方程模型高度顯著，失擬項P值為0.962 3，不顯著，表明回歸方程與實際擬合度較好，可用于韭菜子油超臨界CO2萃取實驗的理論預測。由方差分析結果可知，一次項中影響顯著的因素為萃取溫度(A) 、萃取壓力(B)、萃取時間(C)，且對萃取率的影響大小依次為: 萃取溫度(A)>萃取時間(C)>萃取壓力(B)。二次項中萃取時間(C)的平方對萃取率的影響顯著。3個影響因素之間的互交作用影響不顯著。

2.1.3 提取工藝條件的確定及檢驗

運用Design Expert 12.0設計優化得出最佳萃取條件：萃取溫度59.079 ℃、萃取壓力28.252 2 MPa、萃取時間147.716 min, 考慮到實際操作的局限性，將萃取條件調整為：萃取溫度59 ℃、萃取壓力28.3 MPa、萃取時間148 min。在此條件下進行韭菜子油提取的驗證實驗，3次平行實驗結果的平均值為3.91%，與理論預測值基本相符，驗證了該模型的準確、可靠，也表明優化的萃取條件切實可行。

2.2 韭菜子油的成分組成

對上述最佳工藝條件下萃取得到的韭菜子油進行GC-MS分析，得總離子流圖見圖1，利用NIST14.L標準質譜數據庫和人工譜圖解析相結合的手段，對揮發油成分進行鑒定，并用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，各成分見表4。

圖1 韭菜子油總離子流圖

由表4可知，共鑒定出16個成分，包含13個脂肪酸化合物、1個脂肪醇類化合物、1個酰鹵類化合物和1個萜類化合物。韭菜子油中主要脂肪酸化合物為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、15-羥基亞油酸、硬脂酸、二十二碳二烯酸、二十酸、二十二酸、11-二十碳烯酸等，其中不飽和脂肪占總脂肪酸的88%。根據文獻報道[2,3,9]，韭菜子水提物或者醇提物具有溫腎助陽、固精作用。本次研究進一步驗證了韭菜子的活性成分是中等極性的化合物，不存在于超臨界CO2提取的韭菜子油中。此研究結果對韭菜子油進一步開發成食用保健油具有重要意義。

表4 韭菜子油的主要成分及相對含量

3 結論

通過采用響應面試驗設計方法優化了超臨界CO2萃取韭菜子油的工藝，得到最佳工藝條件為：萃取溫度59 ℃、萃取壓力28.3 MPa、萃取時間148 min，在此條件下，韭菜子油得率為3.91%。

采用GC-MS對韭菜子油成分進行分析，共鑒定出16個成分，包含13個脂肪酸化合物、1個脂肪醇類化合物、1個酰鹵類化合物和1個萜類化合物。其成分以脂肪酸化合物占絕對優勢，主要為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、15-羥基亞油酸、硬脂酸、二十二碳二烯酸、二十酸、二十二酸、11-二十碳烯酸等。