外源硒處理的花生芽蛋白中五種硒形態分析

薛 梅 邵志穎 李 彭

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省糧油品質控制及加工技術重點實驗室；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

花生是我國主要的經濟作物和油料作物，種植面積廣泛。花生營養價值較高，含有易被人體消化吸收的高質量蛋白和豐富的不飽和脂肪酸，其中含有8種人體必需氨基酸，亞油酸和油酸占總脂肪含量的80%左右[1]。此外，花生中的天然多酚物質白藜蘆醇，具有抑菌、防癌、降血脂、抗氧化等保健功能，被科學界廣泛關注[2]。經常食用花生可以改善腦血管功能，延緩衰老，增強記憶，被人們稱為“長生果”[3,4]。同時，花生具有很強的富硒能力，它可以將70%以上從培養基中吸收的無機硒轉化為有機硒[5]，有關花生施用硒元素達到富硒效果以及富硒花生中硒形態的研究已有廣泛報導[6,7]。花生種子發芽過程中，貯藏物質在水解酶的催化作用下被分解成小分子化合物，其營養物質更易于吸收。詹玉婷等[8]發現，與未發芽的花生相比，花生芽主要營養成分中的游離氨基酸和維生素C含量顯著升高，粗脂肪和可溶性蛋白含量顯著減少，活性成分白藜蘆醇的含量也顯著增加。花生芽作為一種新型芽菜品種，具有營養易吸收、風味獨特、經濟價值高、生產周期短、無污染等特點，備受中國消費者的青睞。花生芽也被稱為“長生菜”，除了含有易于被人體吸收的脂肪、植物蛋白等成分，還含有多種維生素和微量元素[9]。此外，花生芽菜中也含有豐富的白藜蘆醇，同樣具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌等保健功效[10]。

硒是人體必需的微量元素之一，是人體部分抗氧化酶和硒蛋白的重要組成部分[11]。該元素可以保護機體不受由自由基引起的氧化性損傷的損害，具有防癌、提高人體免疫力和抗衰老等功效[12]。硒元素無法在體內合成，人體所需的硒元素只能從食物中攝取。在我國，除了湖北恩施等少數地區外，72%的地區都屬于貧硒地帶，全國約三分之二的人口存在不同程度的硒攝入不足[13]，因此，補硒對于提高我國人民身體素質顯得特別重要。由于無機硒不易被吸收，并且易對人體造成毒害[14]，因此經植物轉化后的硒是人體攝入硒的重要來源，目前常采用土壤施硒和噴硒的方式，使無機硒轉化為有機硒，通過農作物進入食物鏈，以供人體利用[15]。然而，土壤施硒很容易造成土壤和環境污染，富硒花生芽的生產可以通過硒溶液浸泡，在無土條件下完成，更加環保。花生中含有豐富的優質蛋白，花生芽生長周期短，加工簡單，營養成分更易吸收，通過花生芽來補充膳食中的硒元素是一種一舉兩得的方法。近年來，有學者研究了多種蔬菜芽菜富硒后的形態種類及變化[16]，Wang等[17]研究了花生芽的富硒機理，發現通過花生幼苗生物轉化作用富集將無機硒轉化為有機硒是培育富硒花生芽的有效手段，其富硒的機理跟花生幼苗的抗氧化系統和次生代謝均存在密切聯系。但對花生芽富硒過程中的硒形態及其分布特征未見報道。本研究通過用Na2SeO3浸泡花生種子，使得無機硒在花生發芽過程中轉化為有機硒，觀察不同外源硒水平對花生芽生長狀況的影響，分析花生芽不同部位無機硒和有機硒的賦存形態，以及不同形態的硒水平。旨在為富硒花生芽的培養和功能開發理論依據，也為花生這一優質營養資源的深度開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硒標準液(1 000 μg/mL)、硒代甲硫氨酸(SeMet，99%)、硒代胱氨酸(SeCys2，98%)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys，95%)、亞硒酸鈉(Na2SeO3，98%)、硒酸鈉(Na2SeO4，98%)、α-淀粉酶、蛋白酶XIV(≥2 500 U/mg)、甲醇(色譜純)、硝酸、磷酸、草酸、氫氧化鈉、次氯酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉(均為優級純)。

1.2 儀器與設備

MARS6微波消解儀，7700x電感耦合等離子體質譜儀，1260系列高效液相色譜儀，人工氣候箱，64R冷凍離心機。

1.3 富硒花生芽發芽工藝

花生種子經篩選、除雜，取100 g成熟飽滿均勻的顆粒，用1% NaClO溶液浸泡5 min，蒸餾水沖洗后，轉移至已消毒燒杯中。平均分成5份，加入100 mL不同濃度的Na2SeO3溶液(濃度分別為 0、10、20、30和40 mg/L)，置于培養箱中25 ℃恒溫浸泡6 h后取出、超純水沖洗、瀝干，均勻鋪在鋪有2層紗布的培養皿(Ф=30 cm)中，均勻噴灑去離子水30 mL，置于人工氣候箱中培養，溫度為32 ℃，濕度為70%，每12 h噴淋20 mL蒸餾水，120 h后停止發芽。花生芽經超純水沖洗后，將子葉、胚軸、胚根三部分分開，分別冷凍干燥，干燥后的樣品用粉碎機粉碎，過40目篩，冷藏備用。

1.4 芽長、芽粗和發芽率

芽長和芽粗：隨機選取20粒發芽花生種子，用最小刻度為0.1 cm 的軟尺對花生芽的長度進行測量；用游標卡尺對芽粗進行測量。

發芽率：按GB/T 3543.4—1995《農作物種子檢驗規程：發芽試驗》，隨機取100粒種子進行花生富硒發芽試驗，統計發芽率。

1.5 標準曲線的制備

Se元素標曲的制備：將Se元素標準工作溶液以1%硝酸-超純水稀釋，配制成0.0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，ICP-MS調諧合格后，將標準溶液引入儀器，測定Se元素和內標元素的信號響應值，以Se元素的濃度為橫坐標，待測元素與內標元素響應信號值的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

硒形態標曲的制備：將5種硒形態標準品混合并逐級稀釋，配置成濃度為0.0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的混合標準工作液，以五種硒形態峰面積-濃度做圖，得到標準曲線。

1.6 樣品中硒蛋白的提取

準確稱取10 g凍干樣品，加入30 mL丙酮攪拌2 h，4 000 r/min離心10 min，棄上清，重復操作3次，將沉淀干燥后得到脫脂樣品。取脫脂后的樣品0.2 g，加入5 mL α-淀粉酶溶液(26.48 mg/mL)，混合溶液在37 ℃水浴中超聲波(40 kHz)30 min，37 ℃下水浴振蕩2 h。再加入2 mL蛋白酶XIV溶液(7.85 mg/mL)于提取液中，在45 ℃水浴中超聲波30 min，然后45 ℃下水浴振蕩2 h提取樣品中硒的化合物。提取液在5 000 r/min下離心20 min，取上清液過孔徑為5 ku的超速離心膜，除去提取液中可能會干擾色譜分析的大分子雜質，經0.45 μm過濾膜后上機分析。

1.7 ICP-MS測總硒含量

稱取0.3 g樣品于消解罐中，加入5 mL HNO3和1 mL H2O2進行微波消解，微波消解程序見表1。消解結束后，冷卻，打開消解罐，樣品溶液轉移至10 mL容量瓶中，用超純水洗滌3次，合并洗滌液，再用超純水定容，搖勻，同樣方法做試劑空白試驗。分別測定花生芽凍干樣品和硒蛋白樣品中的硒含量。

表1 微波消解程序

用ICP-MS測定樣品中總硒含量，ICP-MS儀器參數見表2。

表2 HPLC-ICP-MS分析條件

1.8 花生發芽過程中不同部位消化后硒形態含量測定

硒形態的測定采用HPLC-ICP-MS。ICP-MS和HPLC的工作參數見表2。

硒形態含量計算公式：

式中：X為試樣中每種硒形態的含量/mg/kg；C為樣品溶液中每種硒形態的濃度/μg/L；C0為空白溶液中每種硒形態的濃度/μg/L；V為樣品溶液最終定容體積/mL；M為試樣質量/g；f為稀釋倍數，計算結果保留兩位有效數字。

1.9 數據處理

實驗進行5次重復，每次重復6個平行。采用Origin 8.5對數據進行處理作圖，用SPSS 22.0軟件對結果進行分析，多重比較采用鄧肯氏新復極差法(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 外源硒對花生芽生長情況的影響

由圖1可見，隨著Na2SeO3濃度的升高，花生芽長、芽粗和發芽率均呈下降趨勢。當Na2SeO3濃度為30 mg/L時，芽長開始受到抑制，降低為62.5 mm，顯著低于對照和10 mg/L組。當Na2SeO3濃度升高至40 mg/L時，花生芽生長進一步受到抑制，芽長低至58.8 mm。此外，外源硒濃度低于30 mg/L時，各處理組芽粗沒有顯著差異，當濃度為40 mg/L時，芽粗受到抑制，為5.29 mm，顯著低于對照、10 mg/L和20 mg/L組。發芽率是確定作物播種量的重要依據，也是鑒定種子質量好壞的主要標志[18]。隨著Na2SeO3濃度的升高，花生發芽率呈現下降趨勢。未經硒處理的花生發芽率最高，為96.7%，Na2SeO3濃度低于20 mg/L時，花生發芽率沒有顯著變化。隨著外源硒濃度繼續升高，發芽率顯著降低。綜上指標可見，高濃度外源硒對花生芽的生長具有明顯的抑制作用。胡婷等[19]研究了外源硒對綠豆發芽情況的影響，發現綠豆在Na2SeO3濃度為0.5～5.0 mg/L時發芽率達到最高100.0%，Na2SeO3濃高于10.0 mg/L時，種子發芽率低于對照組。彭誠等[20]研究發現，白菜種子發芽率在較高質量濃度Na2SeO3溶液下表現出抑制作用。王玉鳳等[21]通過研究番茄種子發現，在外源硒質量濃度為4.0 mg/L時，其發芽率最大，種子萌發第7天時的芽鮮質量、根鮮質量、芽長、根長、芽干質量和根干質量也達到最大值；而高質量濃度的硒處理(>4.0 mg/L)則表現為一定的抑制作用。綜合以上研究，高濃度外源硒會不同程度抑制糧食和蔬菜種子的發芽，這與本實驗中花生種子發芽率研究結果一致。

注：同一系列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同濃度硒浸泡的花生發芽5 d后的芽長、芽粗和發芽率

2.2 色譜和質譜條件優化

2.2.1 五種硒形態色譜分離條件優化

本實驗選用Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm，10 μm)陰離子交換柱進行5種硒形態化合物的分離，比較了磷酸二氫銨和檸檬酸2種流動相，結果表明，用40 mmol/L磷酸二氫銨作為流動相時，所測5種硒形態化合物并不能良好的分開，MeSeCys和SeIV形態峰出現重疊。選用6 mmol/L檸檬酸所為流動相時，能夠實現5種不同的硒形態化合物的完全分離，此外，檸檬酸作為流動相，無毒、成分單一易于配置，因此選用檸檬酸作為流動相。有學者在進行硒形態分離時發現，在不同的酸度條件下，硒的不同形態會以陽離子、陰離子或者兩性離子的形式存在，因此，流動相pH值是影響5種硒形態的保留時間和分離效果的主要因素[22]。本實驗比較了檸檬酸pH為4.5、5.0和5.5時的分離效果，結果表明，當pH為4.5時，SeMet和SeIV形態峰出現重疊，不能完全分開；當pH值達到5.0時，SeIV形態峰保留時間縮短，與SeMet峰完全分開，實現了5種硒形態化合物的完全分離，同時，SeVI保留時間明顯縮短，提高了分離效率；當pH值增大至5.5時，MeSeCys和SeIV峰無法完全分開，而SeMet和SeVI峰幾乎重疊。通過優化梯度洗脫發現，當檸檬酸濃度逐漸增大時，SeVI保留時間縮短，當濃度為15 mmol/L時，既可以縮短SeVI的保留時間，又可以實現5種硒形態化合物的完全分離，當濃度大于15 mmol/L時，SeMet和SeVI形態峰重疊。綜合考慮保留時間和分離度，優化5種硒形態化合物混合標準溶液色譜圖見圖3。

圖2 五種硒形態的HPLC-ICP-MS色譜圖

2.2.2 質譜條件優化

質譜干擾包括同量異位素重疊干擾、多原子離子干擾、難熔氧化物離子干擾和雙電荷離子干擾[23]。Se元素的同量異位素中，78Se和80Se會受到40Ar38Ar+、40Ar40Ar+、HBr+等多原子離子干擾，背景值太高不能獲得很好的靈敏度。本研究采用高氦分析模式(HEHe)消除多原子離子干擾，并對儀器條件進行優化，通過7Li、89Y和205Tl矯正儀器，使其分辨率在0.65～0.080 u，氧化物(CeO+/Ce+)≤3%，雙電荷≤2%，確保消除雙電荷、同位素、氧化物、氫化物及多原子離子等物質對結果的干擾。同時，為了消除非質譜干擾，降低基體效應的影響，減少分析信號的漂移，本研究通過內標加入進行定量校正。基于測定同位素豐度最大原則和譜線干擾最少原則，選擇72Ge作為內標，對78Se進行定量測定。

2.3 外源硒對花生芽不同部位硒含量的影響

Se元素標準曲線為y=2.403x+0.999 1，校正曲線線性相關系數為0.999 6，元素的檢出限為0.014 μg/kg。分別測得花生芽各部位總硒含量見表3。

表3 花生芽各部位總硒含量

結果表明，隨著Na2SeO3濃度的升高，各部位硒含量均顯著增加。由各部位硒的分布百分比可見，當Na2SeO3濃度低于10 mg/L，花生芽各部位富硒能力為胚根>胚軸>子葉；當Na2SeO3濃度為20 mg/L，各部位富硒能力為胚根>子葉>胚軸，當Na2SeO3濃度升高至30和40 mg/L，花生芽各部位富硒能力為子葉>胚根>胚軸。Wang等[17]研究發現，Na2SeO3濃度低于10 mg/L時，花生幼苗子葉中的總硒含量顯著低于胚軸和胚根，表明幼苗的根部和下胚軸對硒的富集能力強于子葉。該研究與本實驗結果一致，這可能跟幼苗通過根部吸收和轉化無機硒有密切關系。然而，隨著外源硒濃度升高，子葉中的硒含量比例逐漸升高，胚根和胚軸中硒含量比例逐漸降低，說明高濃度的外源硒抑制了花生發芽過程中硒元素由子葉向胚軸和胚根的轉移。

2.4 外源硒對花生芽各部位硒形態及其含量的影響

2.4.1 HPLC-ICP-MS測定硒形態的線性方程和檢出限

按儀器工作條件對5種硒形態化合物標準溶液系列進行測定，將樣品處理過程的空白溶液連續測定10次，以標準偏差的3倍計算儀器檢出限。5種硒形態的保留時間、線性方程和檢出限，見表4。在0～50 μg/L范圍內，各硒形態校正曲線呈良好的線性關系，線性相關系數為0.999 1～0.999 7，檢出限為0.4～2.2 μg/kg。結果表明，該方法具有較高的靈敏度。

表4 五種硒形態的保留時間、線性方程和檢出限

2.4.2 花生芽蛋白中硒形態及含量

不同濃度外源硒浸泡的花生發芽5 d后，運用HPLC-ICP-MS法分別測定子葉、胚軸、胚根中的硒形態及分布特征，測定圖譜及數據結果分別見圖3和表5。

表5 花生芽蛋白中五種硒形態含量和百分比

圖3 花生芽子葉、胚軸和胚根中的硒形態HPLC-ICP-MS色譜圖

結果表明，當Na2SeO3濃度低于10 mg/L時，3個部位中的硒形態均為SeCys2、SeIV和SeMet 3種，其中SeCys2含量最高，子葉中有機硒百分比為63.72%和63.05%，胚軸和胚根中有機硒則達到75.42%～81.14%，說明在該濃度范圍，花生經過5d發芽，大多數無機硒轉化為有機硒，并且，胚軸和胚根部位有機硒轉換能力高于子葉。當Na2SeO3濃度為20 mg/L時，胚軸和胚根中，除了SeCys2、SeIV和SeMet 3種硒形態外，出現了MeSeCys，含量較低；該濃度下子葉有機硒降低為57.46%，胚軸和胚根中有機硒占比為73.98%和75.21%，說明有機硒轉化率胚根>胚軸>子葉。當Na2SeO3濃度為30 mg/L時，3個部位中的硒形態均為SeCys2、MeSeCys、SeIV和SeMet 4種，其中，子葉部位的SeIV含量最高，占49.01%，顯著高于低濃度處理組，MeSeCys含量最少，占2.78%；胚根和胚軸中4種硒形態含量均為SeCys2>SeIV>SeMet>MeSeCys，且有機硒占比顯著高于子葉，說明胚軸和胚根的有機硒轉化能力高于子葉。當Na2SeO3濃度為40 mg/L時，3個部位均出現5種硒形態，SeVI只有在該濃度下出現，含量最低，占總硒形態的2.97%～4.08%，SeVI的出現可能是大量的SeIV長時間未被吸收而氧化后的結果；各部位有機硒占比為胚軸>胚根>子葉。此外，外源硒濃度為10和20 mg/L時，各部位有機硒所占比例較高，且花生芽生長情況不受影響，適宜作為食用和生產研究參考。

五種硒形態中，有機硒對人體健康均具有積極作用。SeMet被認為是硒的最易吸收的形式，能顯著抑制前列腺癌的患病率；SeCys2最常見于含硒蛋白質，例如谷胱甘肽過氧化物酶、碘甲狀腺原氨酸脫碘酶和硫氧還蛋白還原酶，具有抗氧化和調節甲狀腺功能的作用[24]；MeSeCys具有化學預防作用[25]。隨著外源硒濃度升高，SeCys2在各部位中占比逐漸降低，MeSeCys、SeIV和SeVI逐漸增加，SeMet變化沒有規律，各部位形態組成的變化說明無機硒向有機硒的轉化方式發生了變化。Bodnar等[16]研究了SeVI在西藍花、蘿卜、紅甘藍、芥菜等6種芽菜中的轉化，發現Na2SeO3浸泡的蔬菜種子發芽后，MeSeCys含量增加，該結果與本實驗結果一致。此外，花生芽中總有機硒占比隨著外源硒濃度升高，由75.18%降至50.48%，富硒能力受到顯著抑制。無論是子葉還是胚軸與胚根，都能檢測到無機硒和有機硒兩種形態同時存在，這說明亞硒酸鈉被花生種子吸收后，一部分以無機硒的形式輸送到花生芽的不同部位后再轉化為有機硒，也可能有一部分無機硒在子葉轉化成有機硒后再運輸到其他部位。該結果與先前學者報導結果一致[26,27]。但也有可能涉及植物吸收硒元素以后在植物體內存在無機硒與有機硒的互相轉化過程[28]。

3 結論

無機硒可以通過花生幼苗的生物轉化作用轉化為有機硒富集在花生芽各個部位，是培育富硒花生芽的有效手段。隨著Na2SeO3浸泡濃度的升高，花生芽長、芽粗和發芽率均呈降低趨勢，高濃度外源硒抑制花生芽生長；高濃度的外源硒抑制了花生發芽過程中硒元素由子葉向胚軸和胚根的轉移；未經硒浸泡的花生發芽后，三個部位均檢測到三種硒形態，其中SeCys2占比最高，隨著硒濃度升高，各部位硒形態種類增加，無機硒(SeIV和SeVI)占比逐漸升高，SeCys2和MeSeCys占比逐漸降低，SeMet占比沒有規律性變化，各部位有機硒總量占比降低，無機硒向有機硒轉化率收到抑制。