干熱處理輔助酶法制備多孔淀粉及其對淀粉微觀結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響

林思宇 黃贛輝 何深雄

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室；南昌大學(xué)食品學(xué)院1，南昌 330047)(江西省瑞昌市疾控中心2，瑞昌 332200)

多孔淀粉是一種新型改性淀粉，由于從表面延伸到淀粉顆粒內(nèi)部形成了的大量孔隙，導(dǎo)致了淀粉顆粒的中空結(jié)構(gòu)[1, 2]。因其較天然淀粉具有較大的比表面積和吸附能力，可作為吸附載體或吸附劑，擴大了淀粉的應(yīng)用范圍。作為一種無毒、經(jīng)濟的吸附劑已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)境等行業(yè)[3-5]。在食品工業(yè)中，多孔淀粉被用作香料、甜味劑、酶、調(diào)味品等的載體，Lei等[6]以多孔淀粉為載體制備了橄欖油微膠囊，提高了橄欖油的保質(zhì)期和氧化穩(wěn)定性。Belingheri等[7]研究表明多孔淀粉可用于番茄食品中的風味傳遞，提高風味物質(zhì)的穩(wěn)定性。Zhu等[8]設(shè)計了一種基于多孔淀粉和果膠-殼聚糖復(fù)合物的結(jié)腸靶向藥物(阿霉素)遞送系統(tǒng)，結(jié)果表明所得復(fù)合材料在模擬胃和小腸條件下表現(xiàn)出緩釋藥物的能力。此外，多孔淀粉的吸附也是各種環(huán)境技術(shù)中的一種替代方法，如污水處理，吸附重金屬等。

目前，制備多孔淀粉的方法有化學(xué)、物理、生物方法[9-12]。在這些方法中，酶解方法因其高效的催化能力和溫和的反應(yīng)條件而被廣泛應(yīng)用于制備多孔淀粉，且研究表明不同的酶催化效果不同，同時使用α-淀粉酶和糖化酶進行反應(yīng)制備效果較好[2, 13]。然而，當采用單一方法制備多孔淀粉時，存在一定的局限性，因此，越來越多的研究是結(jié)合不同的方法制備性能更好的多孔淀粉[14,15]。由于酶解的方法效率高，酶解與其他處理相協(xié)同在多孔淀粉的制備中得到了最廣泛的應(yīng)用[16]。Xie等[17]在酶水解前用重復(fù)濕熱預(yù)處理的方法制備小麥多孔淀粉，結(jié)果表明經(jīng)過重復(fù)濕熱預(yù)處理得到的多孔淀粉吸附能力、比表面積和總孔容積均得到顯著提高。吳麗榮等[18]和Majzoobi等[19]研究表明超聲可以提高α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶的催化效率，提高多孔淀粉的制備效果。Zhao等[20]聯(lián)合酶解和凍融處理產(chǎn)生的多孔淀粉的水/油吸附功能得到改善，凍融引起的表面粗糙度增加了顆粒對酶水解的敏感性。

干熱改性(Dry heat treatment，DHT)是指是一種物理改性方法，具體是指在60～200 ℃的溫度范圍內(nèi)，在含水率小于10%狀態(tài)下對樣品進行熱處理[21]。Gou等[22]和Liu等[23]研究表明，DHT在一定程度上能使淀粉特征性質(zhì)發(fā)生變化，如破壞淀粉顆粒表面，改變結(jié)晶度和糊化性質(zhì)等。然而目前關(guān)于DHT對淀粉的改性研究多為膠體輔助干熱處理對淀粉的影響[24,25]，而結(jié)合DHT和酶解制備多孔淀粉的研究較少。本實驗旨在將干熱處理與酶解結(jié)合，以玉米淀粉為原料，采用干熱結(jié)合酶解的方法制備多孔淀粉，并研究對比了不同改性淀粉的吸附性能、結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，以期為干熱結(jié)合酶解制備多孔淀粉的研究和開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉、大豆油；α-淀粉酶(≥10 000U/mL)；糖化酶(≥100 000 U/mL)；所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S3700型掃描電子顯微鏡，D8 ADVANCE型X射線衍射儀，Autosor-iQ型比表面及空隙度測試儀，Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 改性方法

1.3.1.1 干熱處理

研究干熱處理時間、溫度對淀粉酶解產(chǎn)生多孔淀粉吸附容量的影響，以吸油率為評價指標。將天然淀粉樣品放入45 ℃鼓風烘箱中，干燥至淀粉水分含量降到10%以下，再將其于高溫下放置數(shù)小時，得到干熱處理淀粉樣品(DHT-starch，DS)。單因素實驗采用的固定參數(shù)分別為干熱溫度130 ℃，時間3 h。固定其中一個因素，對另一個因素進行優(yōu)化，設(shè)置干熱溫度為70、90、110、130、150 ℃，時間為1、2、3、4、5 h。

1.3.1.2 酶解

稱取10 g玉米淀粉置于250 mL 錐形瓶中，加入pH為5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，按1∶3的配比加入質(zhì)量分數(shù)為2%的α-淀粉酶和糖化酶，將混合溶液放在恒溫搖床上進行8 h的酶解反應(yīng)后，加入一定量的NaOH (2 mol/L)溶液終止反應(yīng)。將懸浮液在 5 000 r/min條件下離心10 min，用蒸餾水將沉淀物洗滌3次后在50 ℃下干燥，粉碎過100目篩，得到酶解多孔淀粉樣品(Porous starch，PS)[2]。

1.3.1.3 結(jié)合處理

將制備的干熱淀粉進行酶解，得到干熱結(jié)合酶解制得的多孔淀粉樣品(DHT-porous starch，DPS)。

1.3.2 吸附能力的測定

1.3.2.1 對水/油的吸附能力

稱取0.5 g多孔淀粉于離心管中，加入5 mL蒸餾水或大豆油后渦旋混合均勻，在室溫下將離心管置于振蕩器中30 min，然后將混合物以 3 000 r/min 離心 5 min 后除去上清液，直到?jīng)]有多余的水或油滴到濾紙上后測量沉淀物的質(zhì)量[13]。并按式(1)計算吸水率/吸油率：

(1)

式中：W0為干基淀粉質(zhì)量/g；W為離心后混合物的質(zhì)量/g。

1.3.2.2 對亞甲基藍的吸附能力

將0.5 g淀粉樣品加入含50 mL亞甲基藍(20 mg/L)水溶液的離心管中，恒溫振蕩器中震蕩2 h后，將混合物在4 000 r/min下離心10 min，用分光光度計測定上清液在665 nm處的吸光值[26]。并按式(2)計算平衡吸附容量：

(2)

式中：Qe為吸附容量/mg/g；V為吸附溶液的體積/mL；C0為MB溶液的初始/mg/L；Ce為MB溶液的平衡濃度/mg/L；m為淀粉樣品的質(zhì)量/g。

1.3.3 淀粉顆粒形態(tài)觀察

取少量淀粉樣品均勻分布于雙面膠上并在真空環(huán)境下進行噴金處理，使用掃描電鏡在10 kV電子束條件下對淀粉進行觀察成像，觀察淀粉顆粒微觀形貌和表面結(jié)構(gòu)[13]。

1.3.4 FT-IR分析

將干燥淀粉樣品與溴化鉀粉末混合壓片，進行紅外掃描，掃描波數(shù)范圍在400～4 000 cm-1[2]。

1.3.5 淀粉晶體結(jié)構(gòu)的測定

采用X-射線衍射儀對淀粉晶體結(jié)構(gòu)進行分析。測定條件：電壓40 kV，電流30 mA，輻射源為CuKα，波長0.54 nm，掃描范圍5°～35°(2θ)，收集衍射圖。樣品的相對結(jié)晶度(RC)通過JADE 5.0 系統(tǒng)計算[27]，以百分比表示。

1.3.6 比表面積及孔徑的測定

測定了液氮溫度-195.8 ℃(77.35 K)下氮氣吸附-解吸等溫線，分別用多點BET(Brunner-Emmet-Teller)和BJH(Barret-Joyner-Halenda)法計算淀粉樣品的比表面積和孔徑及孔徑分布。測定前，淀粉樣品需在100 ℃真空下干燥24 h[28]。

1.3.7 熱特性測定

采用熱重分析儀測定了不同淀粉的熱特性，取10 mg左右樣品，在氮氣中以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃加熱到800 ℃[6]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS24.0 對實驗數(shù)據(jù)進行差異性分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。采用Origin、Excel軟件作圖。每個實驗均做3 次平行，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

圖1為干熱時間和干熱溫度對制得多孔淀粉吸油率的影響。隨著溫度的升高，吸油率先升高后減小。干熱溫度為70 ℃時干熱處理對吸油率無明顯影響，可能是由于在低于淀粉糊化溫度時，干熱處理對淀粉的影響較小。DHT溫度為130 ℃時吸油率達到最高，150 ℃時下降，溫度的升高使淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)開始解旋，顆粒變得疏松，淀粉酶解效率提高，吸油率增大。溫度過高時，淀粉顆粒過于疏松容易導(dǎo)致崩塌，從而吸油率下降[29]。隨著DHT時間的增加，DHT使得淀粉表面出現(xiàn)破損，多孔淀粉的吸油率先上升后下降，干熱時間為3 h時達到最高值，可能是由于時間過長導(dǎo)致淀粉損傷過大，酶解時淀粉過度水解，淀粉顆粒破碎，導(dǎo)致吸附能力降低。

圖1 DHT條件對吸油率的影響

2.2 掃描電鏡分析(SEM)

由圖2可知，天然淀粉表面光滑，多呈卵形、不規(guī)則多邊形等。經(jīng)DHT處理后的淀粉顆粒(圖2B和圖2b)表面有破損，出現(xiàn)裂痕，變得粗糙，且部分淀粉顆粒表面出現(xiàn)凹坑，可見DHT對淀粉顆粒產(chǎn)生了破損作用，但淀粉顆粒形態(tài)仍保持完整，這與Liu等對馬鈴薯淀粉進行干熱處理后的現(xiàn)象一致[23]。PS淀粉表面出現(xiàn)孔洞，酶解反應(yīng)能顯著改變淀粉的顆粒形態(tài)，結(jié)果與Zhang等[2]和Dura等[30]報道一致[2,30]。DPS表面也出現(xiàn)孔洞，且孔洞數(shù)量較PS多。可能是因為DHT破壞了淀粉的表面結(jié)構(gòu)，增加了酶的接觸位點，增大了酶解效率，導(dǎo)致結(jié)合處理淀粉表面產(chǎn)生了數(shù)量更多的孔洞[17]。SEM結(jié)果表明DHT使得淀粉形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這些變化對淀粉的酶解反應(yīng)有促進作用，使得淀粉顆粒形成的孔洞數(shù)量更多。

注：A、B、C、D分別為天然淀粉(NS)、干熱處理淀粉(DS)、酶解多孔淀粉(PS)、干熱-酶解多孔淀粉(DPS)，放大×1 000倍，a、b、c、d 為對應(yīng)淀粉放大×5 000倍。圖2 不同淀粉的掃描電鏡圖

2.3 干熱處理對吸附能力的影響

表1顯示了不同淀粉的吸附能力，天然淀粉經(jīng)過不同處理后，吸附能力均有所改變。經(jīng)干熱處理后淀粉吸附能力略高于天然淀粉，可能是干熱處理使淀粉表面出現(xiàn)的裂痕和凹坑導(dǎo)致了吸附能力的增強。且結(jié)合改性得到的DPS吸附能力最高，其次是單一酶解PS。其中DPS的吸水率、吸油率較PS有顯著提高。亞甲基藍的吸附能力從3.39 mg/g增加至6.10 mg/g，多孔淀粉的吸附過程為物理吸附[26]，表面孔洞大小及數(shù)量可以影響其吸附性能，與酶解淀粉相比，結(jié)合改性制備得到的淀粉吸附能力顯著增大，可能由于DHT使得淀粉表面產(chǎn)生了凹痕促進了酶與淀粉的接觸，或干熱過程中高溫使得淀粉部分雙螺旋結(jié)構(gòu)開始解旋，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)變得疏松[29]，使得酶解反應(yīng)更容易進行，從而促進表面孔洞的產(chǎn)生，吸附能力增強。

表1 不同淀粉的吸附性能

2.4 FT-IR分析結(jié)果

由圖3可見，不同改性的淀粉特征吸收峰的位置沒有變化，這表明干熱處理和酶解均未改變淀粉的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以改性后淀粉的官能團與天然淀粉相似。3 400 cm-1附近的峰和-OH基團有關(guān)，2 929 cm-1處的峰與-CH2的伸縮振動有關(guān)，該處峰值強度的增加表明材料的親脂性也相應(yīng)增加[31]。從圖可見PS在3 400、2 929 cm-1處峰值強度均大于天然淀粉，表明孔洞的產(chǎn)生使得淀粉親水基團和親脂基團均暴露更多。且DPS在這兩處的峰值強度大于PS，說明DHT和酶解結(jié)合制備的多孔淀粉顯露出更多的親水和親脂基團，吸水性和吸油性增強可能與此有關(guān)。

圖3 不同淀粉的FT-IR圖譜

在1 047、1 022 cm-1處的紅外吸收分別與淀粉的結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)有關(guān)，995 cm-1處的吸收與C-6處羥基的分子內(nèi)氫鍵有關(guān)，其中(1 047/1 022) cm-1峰強度比值越大，表明顆粒內(nèi)有序度越高，而(1 022/995) cm-1峰強比值越小，顆粒內(nèi)有序度越高[32]。由表2可見，酶解后淀粉(1 047/1 022) cm-1比值下降，(1 022/995)cm-1增大，表明酶對淀粉顆粒的無定形結(jié)構(gòu)更為敏感，酶解反應(yīng)優(yōu)先在淀粉的無定形區(qū)進行。而DPS的(1 045/1 022) cm-1和(1 022/995) cm-1分別為1.176和0.899，表明DPS的有序度較PS更高，可能與DHT促進酶解反應(yīng)導(dǎo)致淀粉顆粒更多的無定形區(qū)被酶解有關(guān)。

表2 不同淀粉的晶體特征

2.5 淀粉的結(jié)晶性質(zhì)

由圖4可知，四種淀粉均在15°、17°、18°、20°和23°(2θ)有較強的峰，這是A型淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的圖譜[33]，表明DHT和酶解均不會改變淀粉的晶型。淀粉衍射峰強度和相對結(jié)晶度能反應(yīng)淀粉的晶體性質(zhì)，僅經(jīng)DHT后的淀粉較天然淀粉的衍射峰強度無明顯變化，而多孔淀粉PS和DPS相對于天然淀粉衍射峰的強度明顯增強。DS的相對結(jié)晶度為19.67%，較天然淀粉變小，可能是由于DHT使得淀粉結(jié)晶區(qū)受損以及雙螺旋結(jié)構(gòu)的弱化，一定程度上破壞了淀粉的有序結(jié)構(gòu)，淀粉的相對結(jié)晶度降低。經(jīng)過酶解后，淀粉的相對結(jié)晶度增大至21.06%，這可能是由于酶解優(yōu)先在淀粉的無定形區(qū)進行，酶解反應(yīng)使淀粉無定形區(qū)比例下降，從而使結(jié)晶區(qū)比例增加[13]。DPS的相對結(jié)晶度為21.22%，略高于PS，且這與FTIR的結(jié)果一致，可能是由于DHT使得酶促反應(yīng)在更多的無定形區(qū)發(fā)生。

圖4 不同淀粉的X-衍射圖譜

2.6 比表面積和孔徑分布

由圖5可知，兩種多孔淀粉的孔洞多為<20 nm的中孔，一般孔隙分為直徑小于2 nm的微孔、直徑在2～50 nm之間的中孔和直徑大于50 nm的大孔[34]。且DHT結(jié)合酶解得到的多孔淀粉的總孔容積顯著大于僅經(jīng)酶解制得的多孔淀粉，表明結(jié)合改性使淀粉產(chǎn)生了更多的中孔，導(dǎo)致總孔容積增大。由表3可知，DPS的比表面積大于PS的比表面積，PS和DPS的總孔容積分別為21.22×10-3、31.41×10-3cm3/g，而兩種多孔淀粉的平均孔徑大小并無明顯區(qū)別，這表明DHT使得多孔淀粉表面生成了更多的孔洞，是由于孔隙數(shù)量變多而不是使孔徑變大提高吸附能力。這與SEM的結(jié)果一致，DPS表面形成的孔隙比PS表面更多。

圖5 不同淀粉孔徑分布圖

表3 不同淀粉比表面積及孔徑分布

2.7 不同淀粉的熱特性

由圖6可知，4種淀粉均存在兩個熱失重過程，第一階段發(fā)生在100 ℃左右，由淀粉分子內(nèi)結(jié)合水的蒸發(fā)引起。第二階段在160～380 ℃之間，這部分失重是因為淀粉在這個階段開始分解[35]。多孔淀粉的熱分解起始溫度明顯低于未形成孔洞的淀粉，可能是由于孔洞的形成使得淀粉的結(jié)構(gòu)變疏松，導(dǎo)致淀粉耐熱性變差。經(jīng)DHT的淀粉和天然淀粉的熱分解起始溫度相似，但DHT淀粉最大分解速率對應(yīng)的溫度大于天然淀粉，說明DHT使淀粉熱穩(wěn)定性稍有提高。而DPS的開始分解溫度較PS高，最大分解速率對應(yīng)的溫度明顯高于PS，且DPS的熱分解殘余率也大于PS，表明DPS的耐熱性能較PS更好，可能是由于DHT提高了多孔淀粉的致密性。

圖6 不同淀粉的TG-DTG圖

3 結(jié)論

淀粉經(jīng)過DHT后，顆粒表面出現(xiàn)破損和凹坑，有利于酶解反應(yīng)的進行，從而提高了淀粉的酶解效率，與單一酶解制得的多孔淀粉相比，DHT結(jié)合酶解使得淀粉表面產(chǎn)生了更多數(shù)量的孔洞，比表面積和總孔容積顯著增大，淀粉的吸附能力增強。XRD和FT-IR的結(jié)果表明所有淀粉樣品的X射線衍射圖和紅外光譜相似，DHT和酶解均沒有使淀粉產(chǎn)生新的基團，也未改變淀粉的晶型，但孔洞的產(chǎn)生破壞了淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)，且DHT多孔淀粉具有更高的相對結(jié)晶度。此外，熱重分析中DHT多孔淀粉還表現(xiàn)出更好的耐熱性。本研究結(jié)果表明，DHT能有效改善多孔淀粉的性能，制得的多孔淀粉無毒且具有良好的生物相容性，DHT結(jié)合酶解制備的多孔淀粉可作為吸附載體應(yīng)用于食品領(lǐng)域。