CD94_rs2302489和NKG2A 基因多態(tài)性與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性和預(yù)后的關(guān)系

李 靜 高 鵬 王淑云 劉宇宏 霍愛(ài)鑫 （延安大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，延安 716000）

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，疾病晚期可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康［1］。RA 病因復(fù)雜，內(nèi)源性或環(huán)境因素均可觸發(fā)遺傳易感個(gè)體自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病進(jìn)展［2］。據(jù)估計(jì)，至少50%RA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)由遺傳因素決定［3］。RA 發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究表明，自然殺傷（nature kill，NK）細(xì)胞和T 細(xì)胞均參與RA 發(fā)生發(fā)展［4-5］。以上細(xì)胞功能（包括細(xì)胞毒活性和細(xì)胞因子釋放）由NK細(xì)胞和T細(xì)胞各受體傳導(dǎo)的抑制和激活信號(hào)平衡調(diào)節(jié)。

NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞的效應(yīng)反應(yīng)可通過(guò)CD94/NKG2 分子進(jìn)行調(diào)節(jié)，CD94/NKG2A 是 NK 細(xì)胞和 T淋巴細(xì)胞亞群上表達(dá)的抑制性受體，可識(shí)別呈遞標(biāo)準(zhǔn)HLAⅠ類(lèi)衍生肽的非經(jīng)典MHCⅠb類(lèi)人白細(xì)胞抗原 E（HLA-E）配體［6］。表達(dá) HLA-E 的細(xì)胞與 NK 細(xì)胞的主要相互作用是HLA-E 與CD94/NKG2A 抑制受體間的反應(yīng)［7］。CD94/NKG2A-HLA-E 通路可誘導(dǎo)一系列抑制信號(hào)，從而抑制NK 細(xì)胞毒活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生。

CD94/NKG2A 受體影響 NK 細(xì)胞和 T 細(xì)胞調(diào)節(jié)并參與自我耐受維持，其調(diào)節(jié)缺陷可能同時(shí)影響先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致自我耐受和自身免疫反應(yīng)崩潰。因此，這些分子可能RA 發(fā)展的重要促進(jìn)因素。目前，CD94/NKG2A 多態(tài)性鮮有研究，因此，本研究探究CD94/NKG2A 多態(tài)性對(duì)RA 易感性的潛在影響，并評(píng)估CD94/NKG2A 多態(tài)性與抗TNF 治療預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料 選取 2016 年 12 月至 2018 年 12 月我院接受治療的RA患者290例，我院體檢中心體檢的健康受試者130 例，所有患者均符合2010 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）制定的RA 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，抗TNF 治療前，疾病活動(dòng)度評(píng)分（DAS28）>5.1，且至少對(duì)2 種疾病修飾型抗風(fēng)濕藥物（DMARDS）治療無(wú)效。本研究經(jīng)我院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，參與知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝、腎功能?chē)?yán)重受損者；②除RA 外還伴有其他全身性結(jié)締組織疾病者；③患有糖尿病未得到控制者。

1.2 方法

1.2.1 患者一般信息評(píng)價(jià) 評(píng)估基線及抗TNF 治療后第12 周和第24 周患者臨床特征，采用DAS28評(píng)分評(píng)估患者疾病活動(dòng)，根據(jù)EULAR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估臨床反應(yīng)。反應(yīng)良好：和基線相比，ΔDAS28>1.2，且DAS28≤3.2；中度反應(yīng)：ΔDAS28>1.2，且DAS28>3.2，0.6<ΔDAS28≤1.2，且 DAS28≤5.1；無(wú)反 應(yīng) ：ΔDAS28≤0.6，0.6<ΔDAS28≤1.2，DAS28>5.1（表1）。

表1 患者臨床特征［，n=290，例（%）］Tab.1 Patients characteristics［，n=290，n（%）］

表1 患者臨床特征［，n=290，例（%）］Tab.1 Patients characteristics［，n=290，n（%）］

Note：CRP.C-reactive protein；RF.Rheumatoid factor；anti-CCP. Anticyclic citrullinated peptide antibodies.

51.52±11.54 226（77.9）12.63±8.21 39.32±12.32 6.45±0.72 24.35±35.56 191（65.9）277（95.5）150（51.7）124（42.8）266（91.7）270（93.1）Clinical characteristics Age（year）Female Disease duration（year）Disease onset（year）DAS28 at baseline CRP at baseline RF positive Anti-CCP+Anti-TNF drugs Etanercept Adalimumab Glucocorticosteroids Methotrexate

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（SNPs）選擇和基因分型 采用文獻(xiàn)及SNPinfo 網(wǎng)站獲得的功能預(yù)測(cè)，選擇CD94 和NKG2A 基因內(nèi)的多態(tài)性。EDTA 抗凝管采集受試者外周血，根據(jù)說(shuō)明書(shū)采用DNA 純化試劑盒提取DNA。采用實(shí)時(shí)PCR LightSNiP 分析技術(shù)測(cè)定CD94（rs2302489）、NKG2A（rs7301582、rs2734440、rs2734414）多態(tài)性，采用LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用R3.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。群體遺傳學(xué)包評(píng)估基因型頻率的Hardy-Wein?berg 平衡，F(xiàn)isher 精確檢驗(yàn)比較患者和對(duì)照組等位基因、基因型和單倍型頻率，F(xiàn)isher 精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)SNPs 對(duì)抗 TNF 治療的影響，PHASE CD94 和 NKG2A基因的4個(gè)SNPs組合進(jìn)行單倍型重建，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD94、NKG2A 基因型和等位基因在 RA 患者和健康對(duì)照組中的分布 RA 患者和對(duì)照組基因型頻率與Hardy-Weinberg平衡模型預(yù)測(cè)的基因型頻率一致。CD94 多態(tài)性與RA 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與對(duì)照組相比，患者CD94 AA 基因型頻率顯著降低（OR=0.43，95%CI：0.21～0.89，P=0.025），與 AA 純合子相比，CD94 TT 基因型在患者中占主導(dǎo)地位（OR=1.98，95%CI：0.94～4.22，P=0.042，表 2），患者和對(duì)照組未觀察到其他SNPs相關(guān)性。

表2 CD94和NKG2A等位基因、基因型和單倍型在RA患者和健康對(duì)照組中的分布［例（%）］Tab.2 Distribution of CD94 and NKG2A alleles，genotypes and haplotypes in RA patients and healthy control［n（%）］

2.2 RA 患者CD94/NKG2A 基因多態(tài)性與抗CCP抗體的關(guān)系 抗CCP 抗體陽(yáng)性RA 患者CD94 TT 基因型頻率明顯高于抗CCP抗體陰性患者（OR=8.76，95%CI：1.19～387.50，P=0.034，圖 1）；相反，CD94 AA 純合子在抗CCP抗體陰性患者中更為常見(jiàn)（OR=11.29，95%CI：2.38～52.26，P=0.002）。此外，等位基因A 與抗CCP 抗體陰性顯著相關(guān)（OR=5.01，95%CI：1.87～14.95，P=0.003）。

圖1 CD94 rs2302489多態(tài)性與抗CCP抗體存在的相關(guān)性Fig.1 Association of CD94 rs2302489 polymorphism with presence of anti-CCP

2.3 CD94 和 NKG2A 基因多態(tài)性對(duì)抗TNF 治療臨床結(jié)局的影響 CD94 A等位基因與抗TNF治療12周及24 周后更好的EULAR 反應(yīng)顯著相關(guān)（OR=1.91，95%CI：0.98～3.66，P=0.038，OR=1.64，95%CI：1.07～2.52，P=0.016，表 3）。24 周 EULAR 反應(yīng)良好患者中，CD94 AA 基因型頻率顯著升高（OR=3.07，95%CI：0.97～11.44，P=0.039）。與其他基因型的患者相比，CD94 TT 基因型患者12 周后緩解率較低（OR=3.31，95%CI：0.07～0.89，P=0.020）。

表3 第12周和第24周EULAR反應(yīng)與CD94和NKG2A多態(tài)性的關(guān)系［例（%）］Tab.3 Relationship of EULAR responses at 12 and 24 weeks with CD94 and NKG2A polymorphisms［n（%）］

此外，抗TNF 治療臨床結(jié)局與NKG2A rs7301582多態(tài)性相關(guān)。與其他基因型患者相比，攜帶NKG2A rs7301582 C 等位基因患者及NKG2A rs7301582 CC 基因型患者12 周后無(wú)反應(yīng)更為常見(jiàn)（OR=3.67，95%CI：1.13～18.94，P=0.015，OR=3.59，95%CI：1.02～19.42，P=0.028）。此外，與純合子患者相比，NKG2A rs2734440 AG 基因型患者12 周后 EULAR 良好/中度反應(yīng)更為頻繁（OR=3.26，95%CI：1.11～11.63，P=0.024），與其他基因型患者相比，NKG2A rs2734440 AA基因型攜帶者一般治療無(wú)效（OR=2.79，95%CI：1.05～7.98，P=0.025）。對(duì)NKG2A rs2734414 進(jìn)行的分析未能證明與EULAR反應(yīng)顯著修改。

2.4 CD94/NKG2A 單倍型分析 共鑒定出12個(gè)單倍型，本研究選擇其中6 個(gè)最常見(jiàn)的單倍型（TTCA、ATCA、TATG、TTCG、ATCG 和AATG）進(jìn)一步分析，RA 患者與對(duì)照組所選單倍型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅有1 種TATG 單倍型在RA 患者中比對(duì)照組更為常見(jiàn)（OR=1.97，95%CI：1.10～3.64，P=0.021，表2）。

3 討論

本研究表明，RA 易感性可能與CD94 多態(tài)性有關(guān)。RA 患者CD94 rs2302489 AA 基因型頻率顯著低于對(duì)照組。CD94 多態(tài)性也影響RA 患者抗TNF治療臨床療效。CD94 AA 基因型患者更易緩解，而CD94 TT 基因型在EULAR 反應(yīng)較差的患者中更為普遍。表明AA 基因型可能保護(hù)機(jī)體免受RA 發(fā)展侵襲，療效更好，而TT 基因型有益于RA 發(fā)展，且對(duì)抗TNF 治療反應(yīng)更差。研究表明，中國(guó)受試者中，T等位基因與白塞病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，但這種效應(yīng)僅觀察于等位基因水平，并未與易感性相關(guān)基因型相關(guān)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者抗TNF 治療的臨床結(jié)局與NKG2A 多態(tài)性相關(guān)。NKG2A rs2734440 AA 基因型在抗TNF 治療無(wú)反應(yīng)患者中更為豐富，且與治療無(wú)效相關(guān)，但其基因型在患者和健康對(duì)照組間分布無(wú)差異，與關(guān)于NKG2A rs2734440多態(tài)性的研究（自身免疫性疾病的易感性）結(jié)果矛盾。中國(guó)患者中，NKG2A rs2734440 AA 基因型與白塞病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加和RA 風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)［8-9］。研究差異可能反映不同地區(qū)、不同環(huán)境因素的遺傳異質(zhì)性，或可能由于樣本量相對(duì)有限導(dǎo)致。

CD94 和 NKG2A 在 RA 易感性和調(diào)節(jié)抗 TNF 藥物反應(yīng)機(jī)制尚未闡明。CD94 rs2302489（UTR-5 區(qū)域，包含1 個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)）及NKG2Ars7301582和rs2734440（內(nèi)含子區(qū)域）多態(tài)性可能影響轉(zhuǎn)錄或選擇性剪接產(chǎn)生不同產(chǎn)物，部分可能有助于RA 發(fā)病或干擾抗TNF 治療［10］。但這些假設(shè)需要進(jìn)一步遺傳和功能研究，以闡明這些多態(tài)性在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。

考慮到CD94/NKG2A 受體的作用，體外觀察顯示，CD94/NKG2A 阻斷抗體存在下，TNF-α 和 IFN-γ產(chǎn)量增加，說(shuō)明CD94/NKG2A 可能在調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮作用［11］。另外在新發(fā)牛皮癬患者中觀察到NK 細(xì)胞上CD94/NKG2A 受體表面表達(dá)降低［12］。說(shuō)明CD94/NKG2A受體下調(diào)可能阻止CD94/NKG2A 介導(dǎo)的NK 細(xì)胞對(duì)表達(dá)HLA-E 的靶細(xì)胞的抑制并影響活化受體和抑制受體平衡。NK 細(xì)胞過(guò)度活化反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)NK 細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞裂解及過(guò)度促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，有助于疾病發(fā)生和發(fā)展。此外，CD94/NKG2A 受體也與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）發(fā)病有關(guān)，與對(duì)照組相比，這些分子在患者T細(xì)胞上表達(dá)減少［13］。關(guān)于RA 的發(fā)病機(jī)制，已有研究表明，與活動(dòng)性疾病相比，緩解的RA 患者CD94/NKG2A受體在T 細(xì)胞上的表達(dá)升高［14］。綜上，可以假設(shè)由CD94/NKG2A 抑制信號(hào)下調(diào)引起的NK 和T 細(xì)胞活化不足可能導(dǎo)致自身耐受性下降，免疫細(xì)胞向自身組織侵襲并導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)。

總之，本研究證明CD94 基因多態(tài)性可能是RA易感性的潛在候選基因，是第一個(gè)涉及CD94/NKG2A 多態(tài)性對(duì)RA 患者抗TNF 治療功效的研究，需要進(jìn)一步研究其多態(tài)性在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。