基于固相凝集法的IgG抗-A/B檢測方法的建立和評價

張 強 施晶晶 張 敏 （東南大學附屬中大醫院輸血科，南京210009）

ABO 新生兒溶血病（ABO hemolytic disease of the newborn，ABO-HDN）是最常見的由于母胎血型不合引發的胎兒或新生兒同種免疫性溶血性疾病，一般見于含有IgG 抗-A/B 的O 型血孕婦所產的非O型血新生兒［1-2］。IgG 類抗體可穿過胎盤屏障，與含有A 或B 抗原的胎兒紅細胞特異性結合，通過補體介導的細胞溶解作用導致紅細胞溶解破壞，引發胎兒或新生兒貧血、高膽紅素血癥等，嚴重者需要換血［3］。研究證實，孕婦體內 IgG 抗-A/B 效價是 ABO-HDN 發生的重要因素，臨床上用于檢測孕婦IgG 抗-A/B 抗體效價的方法主要為試管法和微柱凝膠法［4-5］。由于血清中同時存在 IgM 和 IgG 2 類血型抗體，2 種方法均需先采用巰基乙醇（2-Mercaptoetha?nol，2-ME）滅活 IgM 類抗體，再檢測 IgG 抗體，檢測時間長，操作復雜，且2-ME 毒性較大，嚴重損傷環境和人體。因此，本研究擬建立一種以固相凝集法為基礎的IgG 抗-A/B 效價檢測方法，滿足檢驗要求的同時顯著提高檢測效率，避免試劑對環境和工作人員的傷害。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取2019 年1 月至7 月我院門診和住院待產的 O 型血孕婦 40 例，年齡 23～45 歲，2019 年江蘇省血液中心健康獻血人員63 例（A、B、AB型各20例，O型3例），微柱凝膠法檢測IgG-抗A/B效價為1∶64、1∶512、1∶1 024的標本各1例。

1.2 儀器與試劑 微柱凝膠檢測系統（37℃恒溫孵育器、微柱凝膠卡及其配套試劑，伯樂）；96 孔U形板（上海晶安）；醫用離心機（北京白洋有限公司）；低離子溶液（伯樂）；巰基乙醇（長春博訊）；抗人球蛋白（抗IgG）檢測試劑盒（上海血液生物有限公司）；Rh-D（IgG）血液定型試劑（單克隆抗體，北京金豪）；磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）、1%O型指示紅細胞懸液為課題組自制。

1.2 方法

1.2.1 血型抗原和指示紅細胞制備 血型抗原制備：分別取A、B 血型健康志愿者唾液10 ml，1 000 g離心10 min，取上清，沸水浴煮沸10 min，滅活唾液酶，1 000 g離心10 min，收集上清。凝集抑制試驗證實上清中存在A/B 血型物質，確定效價，分裝，-20℃保存備用；指示紅細胞制備：取3 人份O 型血獻血人員細胞，鹽水洗滌3 次，稀釋為1%O 型紅細胞懸液，取 2 ml 紅細胞懸液，加入 15 μl IgG 抗-D，37℃孵育30 min，制備1%O型指示紅細胞。

1.2.2 固相凝集法建立 采用磷酸鹽緩沖液將A、B 血型抗原稀釋至最佳濃度，包被96 孔U 形板（200 μ/l 孔），4℃ 過夜；洗滌 3 次，反應孔中加入200 μl 倍比稀釋的患者血清（1∶100、1∶200……1∶1 600）和陰性對照血清，密封，37℃ 孵育30 min；洗滌5次，依次加入100 μl抗人IgG抗體及100 μl指示紅細胞，混勻，200 g離心5 min，觀察結果，指示紅細胞平鋪于反應孔底部形成細胞層為陽性，指示紅細胞聚集于反應孔底部中央為陰性，以達到1+的最高稀釋度作為待測血清的抗體效價。

1.2.3 特異性檢驗 采用包被A 抗原的96 孔U 形板檢測A 及AB 型健康獻血人員（無IgG 抗-A）血清各 20 例，包被 B 抗原的 96 孔 U 形板檢測 B 及 AB 型健康獻血人員（無IgG 抗-B）血清各20 例，同時加入IgG 抗-A 和 IgG 抗-B 陽 性 的 O 型血孕婦血清 作 為 陽性對照。

1.2.4 批內與批間差異檢測 選擇微柱凝膠法檢測的低、中、高（IgG 抗-A 1∶64、1∶256、1∶1 024和IgG抗-B 1∶64、1∶256和1∶1 024）3個不同抗體效價水平的標本采用建議的方法進行檢測，各標本連續檢測20次，計算批內變異系數；對3個不同水平的標本連續檢測20 d，1次/d，計算批間變異系數（CV）。

1.2.5 固相凝集檢測法臨床應用 分別采用固相凝集法和試管法檢測40 例O 型血孕婦IgG 抗-A/B效價（20 例 IgG 抗-A、20 例 IgG 抗-B），比較 2 種檢驗結果。

1.3 統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行統計學分析，重復性驗證試驗中，抗體效價倒數經log轉換，計算其均值（）和標準差（s）。2種方法比較試驗中，抗體效價測定值以幾何均數G（+1 SD，-1 SD）表示，不同方法檢測結果差異比較采用配對t檢驗，相關性檢驗采用Pearson 相關分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血型抗原最佳包被濃度確定 制備好的血型抗原按1∶100、1∶200……1∶1 600 倍比稀釋，以本研究建立的方法分別檢測低、中、高效價標本，選擇可同時檢測出3個水平抗體的抗原最適稀釋度作為包被濃度，確定包被濃度為1∶400。

2.2 特異性 采用包被A 抗原的96 孔U 形板檢測無IgG抗-A的健康獻血人員血清，結果均為陰性；采用包被B抗原的96孔U 形板檢測無IgG 抗-B的健康獻血人員血清，結果均為陰性，陽性對照血清均為陽性。說明包被最佳濃度血型抗原的96 孔U 形板可特異性檢測到相應抗體的血清，與非特異性抗體不發生反應，本研究建立的固相凝集方法特異性良好。

2.3 重復性驗證 3 個不同抗體效價水平的血樣經連續檢測，效價倒數經log轉換，計算其、s及CV，得到 IgG 抗-A 的批內差異為 2.19%～6.90%（<10%），批間差異為4.47%～8.15%（<10%）；IgG 抗-B的批內差異為3.03%～6.10%（<10%），批間差異為3.17%～8.80%（<10%）。見表1。

表1 固相凝集法檢測IgG抗-A/ B的批內及批間差異Tab.1 Intra-and inter-assay coefficients of variations for IgG-A/ B antibody titer detected by Solid Phase Agglutination

2.4 不同檢測方法比較 分別采用固相凝集法和試管法檢測40 例O 型血孕婦抗體效價（20 例IgG抗-A、20 例 IgG 抗-B），配對t檢驗結果顯示，固相凝集法檢測IgG 抗-A/B 的靈敏度高于試管法，IgG 抗-A/B 測定值分別為試管法的5.86 倍和9.19 倍，差異有統計學意義（P<0.05，表2）。Pearson 相關分析顯示，2 種方法的檢測結果高度相關，IgG 抗-A 檢測相關系數為0.700，IgG抗-B檢測相關系數為0.638，差異有統計學意義（P<0.05，表3）。

表2 固相凝集法與試管法檢測結果比較Tab.2 Comparison of Solid Phase Agglutination and Tube Test

表3 固相凝集法與試管法相關性分析Tab.3 Pearson correlation analysis of Solid Phase Agglu?tination and Tube Test

3 討論

本研究采用唾液血型物質作為包被抗原，成功建立了IgG 抗-A/B 檢測的固相凝集檢測方法，并進行了系統評價和初步應用，本方法特異性高，重復性好，檢測結果與經典方法高度相關。

目前臨床常用孕婦抗體效價檢測方法主要為試管法和微柱凝膠法。試管法是檢測血型抗體效價的經典方法，操作復雜，未被完全滅活的IgM 抗體和IgA 抗體干擾可引發鹽水凝集導致假陽性，現已不常用。微柱凝膠法利用分子篩作用，將凝集紅細胞與游離紅細胞分開，靈敏度較高，但存在明顯不足，未滅活完全的IgM 抗體、高白細胞、冷凝集及異常蛋白等均會引發假陽性［6-8］。近年固相凝集法檢測血小板抗體及血小板交叉配型的試劑盒已成功應用于臨床，且具有較高特異性和敏感性［9-10］。本研究采用特異性單抗（抗人IgG）作為二抗及IgG 抗-D致敏的O 型紅細胞作為指示紅細胞，檢驗過程不受IgM 類血型抗體干擾，無需滅活IgM 類抗體，顯著縮短檢測時間（相比于試管法和微柱凝膠法可節省30～60 min），明顯提高檢測效率［11］。同時該法避免使用2-ME 等有毒試劑，使工作人員免受毒性試劑損傷，且靈敏度高于試管法，其IgG 抗-A/B 的測定值分別為試管法的5.86 倍和9.19 倍。Pearson 相關性分析結果顯示，2 種方法檢測IgG 抗-A/B 的結果顯著相關。另外，本研究以分泌型人唾液中的血型物質作為包被抗原，其僅與含有相應IgG 抗體的血清反應，不與陰性對照血清發生交叉反應，保證該方法特異性良好。重復性試驗顯示，該方法檢測IgG 抗-A/B 的批內和批間變異系數均<10%，具有較好的重復性和精密度。

綜上所述，本研究建立方法特異性和靈敏度較高，重復性好，無毒性試劑污染，且操作簡便省時，為檢測孕婦血清IgG抗-A/B抗體效價提供了可靠手段。