miR-591靶向ABCC3對肺癌細胞吉西他濱耐藥性的影響

林輝雄 林海鋒 逯 妍 王小泉 王聞通 （瓊海市人民醫(yī)院腫瘤內科，瓊海571400）

肺癌是全世界癌癥相關死亡的最常見原因［1］。目前，肺癌的標準治療策略包括手術切除、化學療法和放射療法，化學療法仍是晚期肺癌的常用治療方案之一［2］。吉西他濱作為一線治療藥物已被用于肺癌治療，但耐藥性限制其臨床應用，耐藥性的確切機制尚未闡明，耐藥性相關基因仍需進一步探索［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是內源性非編碼RNA，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵調控因素［4］。miR-591 在多種生物學和病理學過程中起重要作用，備受關注。研究表明，miR-591 在乳腺癌組織中表達下調，過表達miR-591 抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲［5］。miR-591在肝癌細胞中呈低表達，可緩解肝癌細胞耐藥性［6］。ABCC3 是ATP-結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白家族成員，ABC 轉運蛋白在腫瘤細胞中高表達，可主動釋放多種抗腫瘤藥物，導致多藥耐藥［7］。ABCC3 在腦膠質瘤中表達升高，在非小細胞肺癌耐藥細胞中高表達，干擾ABCC3表達可抑制膀胱癌細胞的集落形成，增強癌細胞對順鉑的敏感性［7-9］。但miR-591在肺癌細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞中的表達及其對肺癌細胞吉西他濱耐藥性的影響，以及miR-591 是否通過靶向調控ABCC3 表達影響肺癌細胞吉西他濱耐藥性尚未明確。因此，本研究建立肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR，并觀察miR-591 對其增殖、凋亡的影響，并結合ABCC3探索其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細胞株A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；吉西他濱（99.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；吉西他濱購自美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8 檢測試劑盒購自日本Dojindo 公司；雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega 公司；Annexin VFITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術研究所；BCA 蛋白測定試劑盒購自美國Pierce 公司；ABCC3、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）一抗購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與耐藥細胞株（A549/GR）構建 采用含10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細胞，37℃、5%CO2的潮濕條件下培養(yǎng)。參考 WEI 等［10］方法構建A549/GR 細胞株，將對吉西他濱敏感的A549 親本細胞連續(xù)暴露于濃度逐漸增加的吉西他濱中，初始濃度為10 nmol/L，6個月后增加至10 μmol/L。

1.2.2 細胞轉染與處理 肺癌A549細胞或吉西他濱耐藥細胞株A549/GR 接種于6 孔板，待細胞生長至70%融合，按照說明書，采用Lipofectamine2000將miR-591、si-ABCC3、pcDNA-ABCC3及相應陰性對照轉染至細胞，吉西他濱（0.1 μmol/L）處理48 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞以5×103個/孔接種于96 孔板，37℃下采用不同濃度吉西他濱（0.01、0.1、1、2、5、10 μmo/lL）處理A549、A549/GR細胞48 h，或收集轉染后的A549/GR細胞，10 μ/l孔加入CCK-8 溶液，37℃、5%CO2孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度（OD）值，計算細胞增殖抑制率和半數抑制濃度（IC50）。

1.2.4 qRT-PCR 檢測 miR-591 和 ABCC3 mRNA 表達 采用 TRIzol 提取 A549 和 A549/GR 細胞總RNA，采用PrimeScripte RT 試劑盒進行逆轉錄，SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒進行 qPCR 反應，以GAPDH 為內參，2-ΔΔCt法計算基因相對表達。引物序列：miR-591 F：5'-GAGGTAGACCATGGGTTCTCA-3'，R：5'-AGCCAGGGAGTCCACAGTTA-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；ABCC3 F：5'-CCTTTGCCAACTTTCTCTGC-3'，R：5'-AGGGCACTCAGCTGTCTCAT-3'；GAPDH F：5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'，R：5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'。

1.2.5 TargetScan 預測和雙熒光素酶報告實驗 TargetScan 網站（http：//www. targetscan. org/）預測 miR-591 靶基因，ABCC3 3'UTR 中預測 miR-591的假定結合位點。分別構建野生（WT）和突變（MUT）-ABCC3 質粒，采用Lipofectamine2000 試劑共轉 染 WT-ABCC3 或 MUT-ABCC3 與 miR-591 模 擬 物或miR 陰性對照（NC），轉染后48 h，雙熒光素酶報告分析試劑盒評估熒光素酶活性。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 A549/GR 細胞在 Binding Buffer 緩沖液中稀釋至 1×105個/ml，取100 μl 細胞懸液加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI工作液，室溫避光孵育15 min，BD FACSCalibur 流式細胞儀分析染色細胞。

1.2.7 Western blot 檢 測 ABCC3、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達 采用冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，與含有蛋白酶抑制劑混合物的冷RIPA 緩沖液孵育，冰上裂解30 min，4℃ 離心15 min。采用BCA 蛋白測定試劑盒測定上清中蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%）分離等量蛋白（20 μg），轉至PVDF膜，加入ABCC3、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax一抗（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）4℃ 孵育過夜，加入相應二抗室溫孵育2 h，采用增強的化學發(fā)光檢測劑顯影，ImageJ軟件定量分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，數據以表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度吉西他濱對肺癌A549 細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR抑制率的影響 CCK-8檢測結果顯示，與A549細胞相比，0.01、0.1、1、2、5、10 μmo/lL 吉西他濱顯著降低A549/GR 細胞增殖抑制率；吉西他濱作用的A549/GR 細胞IC50顯著高于A549細胞（P<0.05，表1）。

表1 不同濃度吉西他濱對肺癌細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞抑制率的影響（，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of gemcitabine on lung cancer cells and lung cancer gemcitabine-resistant cells（，n=9）

表1 不同濃度吉西他濱對肺癌細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞抑制率的影響（，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of gemcitabine on lung cancer cells and lung cancer gemcitabine-resistant cells（，n=9）

Note：Compared with A549，1）P<0.05.

Groups Gem concentration（μmol/L）1 2 5 IC50 1.21±0.14 47.58±4.131）33.663 0.000 A549 A549/GR t P 0.01 11.02±1.17 6.34±0.631）10.566 0.000 0.1 28.46±2.84 10.25±0.911）18.391 0.000 41.33±4.15 15.44±1.231）17.944 0.000 52.69±5.18 24.36±1.571）15.702 0.000 66.32±6.22 31.42±1.741）16.210 0.000 10 79.68±6.22 36.14±2.181）16.033 0.000

2.2 miR-591和ABCC3 在肺癌A549 細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR 中的表達 qRT-PCR 和Western blot 檢測結果顯示，與A549 細胞相比，A549/GR 細胞中miR-591 表達明顯減少，ABCC3 mRNA和ABCC3蛋白表達顯著增加（P<0.05，圖1）。

圖1 肺癌A549細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR中miR-591、ABCC3表達Fig.1 Expressions of miR-591 and ABCC3 in lung cancer cells A549 and lung cancer gemcitabine-resistant cells A549/GR

2.3 miR-591靶向調控ABCC3表達 TargetScan 預測發(fā)現，miR-591 與ABCC3 3'UTR 區(qū)堿基可形成互補配對（圖2A）。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC 組相比，miR-591 明顯降低 WT-ABCC3 細胞熒光素酶相對活性（P<0.05），而對MUT-ABCC3 細胞熒光素酶相對活性無顯著影響（圖2B）。Western blot檢測結果表明，與miR-NC 組相比，轉染miR-591明顯降低ABCC3 蛋白表達；與anti-miR-NC 組相比，轉染anti-miR-591 顯著提高ABCC3 蛋白表達（P<0.05，圖2C）。

圖2 miR-591靶向調控ABCC3表達Fig.2 miR-591 targeting regulates ABCC3 expression

2.4 miR-591 過表達聯合吉西他濱（0.1 μmol/L）對A549/GR細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響與 Con 組相比，Gem+miR-NC 組、Gem+miR-591 組A549 細胞和 A549/GR 細胞中 miR-591 表達明顯降低，抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白表達顯著提高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平明顯降低；與Gem+miR-NC組相比，Gem+miR-591 組 A549 細胞和 A549/GR 細胞miR-591表達、抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表達明顯提高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P<0.05，圖3、表2）。

表2 miR-591 過表達聯合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.2 Effects of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

表2 miR-591 過表達聯合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.2 Effects of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

Note：Compared with Con，1）P<0.05；compared with Gem+miR-NC，2）P<0.05.

Groups Con Gem+miRNC Gem+miR-591 A549/GR Inhibition rate 0.00±0.01 Apoptosis rate 6.22±0.61 A549 Inhibition rate 0.00±0.02 Apoptosis rate 7.36±0.74 7.25±0.761）7.15±0.7229.65±2.411）19.32±1.331）33.58±3.351）2）22.69±2.231）2）52.66±5.171）2）31.54±3.111）2）329.000 0.000 F P 714.438 0.000 394.187 0.000 578.333 0.000

圖3 miR-591 過表達聯合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells

2.5 干擾ABCC3 表達聯合吉西他濱（0.1 μmol/L）對A549/GR細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響與 Con 組 相 比 ，Gem+si-NC 組 、Gem+si-ABCC3 組A549/GR 細胞和A549 細胞抑制率、凋亡率、ABCC3、p21、Bax蛋白水平明顯提高，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達顯著降低；與Gem+si-NC 組相比，Gem+si-ABCC3 組 A549/GR 細胞和 A549 細胞抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白水平明顯提高，ABCC3、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達明顯降低（P<0.05，圖4、表3）。

表3 干擾ABCC3 表達聯合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.3 Effects of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

表3 干擾ABCC3 表達聯合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響（，n=9，%）Tab.3 Effects of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells（，n=9，%）

Note：Compared with Con，1）P<0.05；compared with Gem+si-NC，2）P<0.05.

Groups Con Gem+si-NC Gem+si-ABCC3 A549/GR Inhibition rate 0.00±0.01 9.87±0.991）Apoptosis rate 6.24±0.61 6.58±0.66 A549 Inhibition rate 0.00±0.02 27.14±2.651）Apoptosis rate 7.14±0.71 18.69±1.331）31.25±3.121）2）19.45±1.881）2）48.33±4.271）2）27.31±2.411）2）342.207 0.000 F P 643.036 0.000 352.630 0.000 627.429 0.000

圖4 干擾ABCC3 表達聯合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells

2.6 ABCC3 過表達逆轉miR-591 過表達對肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR 吉西他濱耐藥性的作用 與 Gem+miR-NC 組 相 比 ，Gem+miR-591 組A549/GR 細胞 ABCC3、CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達明顯減少，細胞抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白水平顯著提高（P<0.05），與Gem+miR-591+pcDNA 組相比，Gem+miR-591+pcDNA-ABCC3 組 A549/GR 細 胞ABCC3、CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平明顯升高，細胞抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表達顯著降低（P<0.05，表4、圖5）。

表4 ABCC3 過表達逆轉miR-591 過表達在肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR中的作用（，n=9，%）Tab.4 ABCC3 overexpression reversed miR-591 overex?pression on lung cancer gemcitabine resistant cells A549/GR（，n=9，%）

表4 ABCC3 過表達逆轉miR-591 過表達在肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR中的作用（，n=9，%）Tab.4 ABCC3 overexpression reversed miR-591 overex?pression on lung cancer gemcitabine resistant cells A549/GR（，n=9，%）

Note：Compared with Gem+miR-NC，1）P<0.05；compared with Gem+miR-591+pcDNA，2）P<0.05.

Apoptosis rate 6.935±0.71 21.36±2.141）23.65±2.33 13.28±1.332）172.497 0.000 Groups Gem+miR-NC Gem+miR-591 Gem+miR-591+pcDNA Gem+miR-591+pcDNA-ABCC3 F P Inhibition rate 10.65±1.13 35.58±3.481）37.19±3.71 19.25±1.282）207.463 0.000

3 討論

吉西他濱作為一線化療藥物，廣泛用于多種癌癥治療，包括肺癌治療［11-12］。盡管患者治療開始時對吉西他濱反應良好，但部分患者最終會產生繼發(fā)性耐藥，導致治療失敗，并最終導致死亡［13］。因此，吉西他濱耐藥性分子機制的進一步研究將促進新型治療方法開發(fā)并改善患者預后。本研究在體外建立肺癌吉西他濱耐藥細胞株A549/GR，發(fā)現不同濃度吉西他濱處理的A549/GR 細胞增殖抑制率明顯低于A549 親本細胞，IC50顯著高于A549 細胞，說明耐藥A549/GR 細胞對吉西他濱敏感性顯著降低。本研究考察 miR-591 和 ABCC3 在 A549/GR 細胞中的表達，及其對細胞耐藥性的影響，有助于克服肺癌吉西他濱耐藥的靶向療法開發(fā)。

肺癌耐藥發(fā)病機制中，miRNA 失調起關鍵作用［14］。已確定多種miRNA 失調與肺癌化療耐藥性有關，如 miR-324-5p、miR-140-5p、miR-326 等［15-17］。既往研究表明，miR-591 在惡性胸膜間皮瘤組織中明顯下調，是惡性胸膜間皮瘤中一種有效的腫瘤抑制因子［18］。miR-591 與乳腺癌放療抵抗性密切相關［19］。耐紫杉醇的卵巢癌細胞中，miR-591 顯著下調，恢復miR-591 表達可使耐藥性卵巢癌細胞對紫杉醇重新敏感，并可能通過抑制其靶基因ZEB1 降低癌細胞遷移和增殖，但其在肺癌吉西他濱耐藥細胞中的表達和機制尚未闡明［20］。本研究中，與A549細胞相比，A549/GR細胞中miR-591表達明顯減少，提示miR-591 影響肺癌細胞對吉西他濱的敏感性。功能實驗結果發(fā)現，miR-591 過表達可抑制吉西他濱作用的A549/GR 細胞增殖，并誘導細胞凋亡，從而降低肺癌細胞對吉西他濱的耐藥性，與HUH等［20］報道結論相符。

轉運蛋白ABC 家族表達增加與化療失敗有關，ABCC3 與多種耐藥性和較差的臨床反應聯系密切［21］。懸浮狀態(tài)使乳腺癌細胞MDA-MB-231耐藥性增強，也可誘導ABCC3 表達增加，而ABCC3 沉默顯著降低懸浮MDA-MB-231細胞耐藥性［22］。人膀胱癌組織中ABCC3 mRNA 和蛋白水平顯著高于正常組織，過表達ABCC3 可促進細胞增殖、耐藥和需氧糖酵解，并與膀胱癌患者不良預后有關［23］。敲除乳腺癌化療患者ABCC3，化療藥物在乳腺癌細胞中的保留和細胞凋亡明顯增加，敏感性更高。本實驗A549/GR細胞中ABCC3 mRNA 和ABCC3 蛋白表達顯著增加，與既往報道一致［9］。干擾ABCC3 表達可抑制吉西他濱作用的A549/GR 細胞增殖，并促進其凋亡，增強肺癌細胞對吉西他濱的敏感性，減輕其耐藥程度。進一步研究發(fā)現，miR-591 可靶向調控ABCC3表達。ABCC3過表達逆轉miR-591過表達對吉西他濱作用的A549/GR 細胞增殖、凋亡、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響。說明miR-591 逆轉肺癌細胞對吉西他濱的耐藥性可能通過靶向調控ABCC3表達實現。

綜上所述，miR-591 在肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR 中表達下調，過表達miR-591 可抑制吉西他濱誘導的A549/GR 細胞增殖，并促進其凋亡，減輕肺癌細胞對吉西他濱的耐藥性，機制與靶向調控ABCC3 表達有關，為吉西他濱治療肺癌的耐藥性提供了新見解。