阻斷TLR2和TLR4緩解UVB導致的HaCaT細胞損傷作用①

楊 慧 李 浩 馮立爽 楊卓東 楊 煜

（吉林大學公共衛生學院預防醫學實驗教學中心，長春130021）

皮膚作為人體最大的一個器官，是抵御外界刺激的第一道防線。在過去的30年中，各類皮膚炎癥疾病以及皮膚癌的發病率一直在不斷增加［1］。流行病學研究表明，UV 輻射仍然是皮膚癌最重要的可干預風險因素［2］。太陽紫外線輻射（UV）可分為UVA（315～400 nm），UVB（280～315 nm）和 UVC（100～280 nm）。UVB 輻射是導致皮膚癌的主要危險因素［3］。過量的UVB 暴露會破壞體內生物大分子，包括蛋白質、脂質和核酸，使細胞產生自由基，發生氧化應激、凋亡等反應，最終導致皮膚炎癥性疾病、皮膚癌等［4-6］。然而，UVB 是否通過影響免疫系統介導皮膚損傷還未明確。

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類重要蛋白質分子，主要表達在免疫細胞上，通過識別多種病原微生物進化中的保守分子如酵母多糖、脂多糖、肽聚糖等，激活細胞內信號傳遞，介導天然免疫，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。目前已發現11 種TLR（TLR1～11）。有研究表明，TLR2 和 TLR4 參與多種皮膚疾病的發生發展，并且皮膚炎癥性疾病中TLR2、TLR4的表達升高，但其是否參與UVB誘導的皮膚炎癥性疾病并不清楚［5］。研究顯示皮膚角質形成細胞如HaCaT 中也可表達TLR2 和TLR4，因此是否是皮膚角質形成細胞本身，而非免疫細胞中表達的TLR2 或TLR4 參與UVB 誘導的皮膚損傷并不清楚。內質網應激是細胞為應對內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂等狀況，而激活未折疊蛋白反應、內質網超負荷反應和cas?pase 介導的凋亡通路等信號途徑的反應過程［7］。TLRs 激活或內質網應激被誘導所產生的信號可以相互融合，促進病理炎癥反應，損傷皮膚角質細胞并最終可引起細胞凋亡，但目前TLR 信號和內質網應激相互作用的機制尚不清楚［8］。C29是TLR2 抑制劑，TAK-242 是TLR4 抑制劑，二者可有效阻斷這2 個受體相關的信號通路，因此常采用2 種抑制劑，阻斷相應的信號傳導通路用于各種研究工作。

本文擬利用C29和TAK-242 探討阻斷TLR2 和TLR4 能否緩解UVB 導致的HaCaT 細胞損傷作用并分析內質網應激的變化，探究TLR2 和TLR4 在UVB所致的細胞損傷中的作用。為預防及治療UVB 引起的皮膚疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人永生化角質形成細胞（human immor?tal keratinocyte，HaCaT）購自中科院上海細胞庫。C29、TAK-242（MCE 中國皓元生物公司）；一抗Cas?pase8、NF-κB、p-NF-κB、PERK、P-PERK、IRE1α（美國CST 公司）；GAPDH（北京博奧森公司）；山羊抗兔、鼠（北京鼎國昌盛公司）。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 細胞培養 含10%胎牛血清（BI，以色列）的DMEM 培養基培養HaCaT 細胞，將細胞置于37℃，5%CO2恒溫培養箱中。每隔48 h 更換培養基，待細胞融合至80%左右時，進行消化傳代。

1.2.2 細胞分組及處理 正常組：正常培養的Ha?CaT 細胞；UVB 組：細胞給予 UVB 照射處理；UVB+C29組：細胞給予 C29預處理 2 h 后，給予 UVB 照射；UVB+TAK-242組：細胞給予TAK-242預處理2 h后，給予UVB照射；UVB+C29+TAK-242組：細胞給予C29和TAK-242預處理2 h后，再給予UVB照射。

1.2.3 UVB 照射HaCaT 細胞 取對數生長期的HaCaT 細胞，3×103個/孔細胞接種 96 孔板，每組設置6個復孔，分別照射不同時間：30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s，照射時將培養皿蓋子打開置于紫外線燈下，培養皿距離燈源約20 cm，總輻射劑量30 mJ/cm2。

1.2.4 MTT 法檢測HaCaT 細胞存活率 取對數生長期的HaCaT 細胞，3×103個/孔細胞接種于96 孔板，每組各設置6個復孔，根據細胞不同分組進行不同處理。然后根據MTT 試劑盒使用說明書進行操作，每孔加入10 μl MTT（5 g/L），置于37℃ 孵育4 h，棄培養基，每孔加入150 μl DMSO，振動5 min 后，使用酶標儀測量反應溶液在490 nm 處的吸光度值。根據說明書給出的公式計算細胞存活率。細胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%（As 為實驗組吸光度值、Ab為空白組吸光度值、Ac為對照組吸光度值）。

1.2.5 TLR2、TLR4 抑制劑 C29和 TAK-242 處理 Ha?CaT細胞 取對數生長期的HaCaT細胞，3×103個/孔細胞接種96 孔板，每組設置6 個復孔，待細胞貼壁后分別給予含 5 μmo/lL、10 μmo/lL、25 μmo/lL、50 μmo/lL、75 μmo/lL、100 μmo/lL、150 μmo/lL、200 μmo/lL、250 μmo/lL 濃度的 C29和 0 μmo/lL、0.01 μmo/lL、0.1 μmo/lL、1 μmo/lL、2 μmo/lL、5 μmo/lL、10 μmo/lL、12 μmo/lL、15 μmo/lL、20 μmo/lL 濃度的 TAK-242（培養基培養 2 h，根據MTT試劑盒使用說明書進行操作，置于37℃，5%CO2培養箱中孵育2 h，使用酶標儀測定反應溶液在490 nm 處的吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%（As 為實驗組吸光度值、Ab為空白組吸光度值、Ac為對照組吸光度值）。

1.2.6 Western blot 法檢測蛋白表達 棄掉培養皿的培養液，用PBS 緩沖液清洗細胞2 遍，然后用0.25%胰蛋白酶將細胞消化并轉移到EP管中，加入適量的培養液1 000/rmin，5 min離心；棄掉上清，加入適量 PBS 緩沖液重懸細胞，2 000/rmin，5 min 離心；重復此步驟2 次；每管細胞中加入200 μl 的RIPA 裂解液，然后用量程為200 μl的槍頭小心將細胞重懸，冰上裂解30 min，每5 min 振蕩1 次；裂解完畢后，4℃，12 000/rmin，離心5 min；吸取上清至準備好的另一新EP 管，4℃存放、準備BCA 蛋白定量；將標準蛋白BCA 按照試劑說明書配制成濃度為25 mg/ml 的標準蛋白母液，然后準確吸取3 μl 標準蛋白母液、147 μl 的 RIPA 裂解液，將標準蛋白母液稀釋成濃度為0.5 mg/ml。稀釋標準蛋白，取待測樣品，進行蛋白定量。然后按照Western blot常規測定方法，進行蛋白電泳、轉膜、顯影。分別加入一抗Caspase-8（兔抗人 1∶1 000 倍稀釋）、NF-κB（鼠抗人1∶1 000倍稀釋）、p-NF-κB（鼠抗人1∶1 000倍稀釋）、PERK（兔抗1∶1 000倍稀釋）、P-PERK（兔抗1∶1 000倍稀釋）和IRE1α（兔多抗1∶500 倍稀釋）的表達，內參選擇 GAPDH（兔抗人1∶2 000 倍稀釋），二抗為HRP 標記的山羊抗兔、鼠（1∶1 000 倍稀釋），通過ECL 發光顯影檢測，并通過Image J 軟件進行蛋白灰度值測定。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料采用表示，多組之間進行比較采用單因素方差分析ANOVA，兩兩比較采用SNK法，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 UVB 最佳照射時間的確定 為了確定UVB 照射造成HaCaT 細胞損傷作用的最佳時間，采用MTT法檢測細胞存活率，結果顯示隨著UVB 照射時間的延長，HaCaT 細胞的存活率逐漸降低，UVB 照射時間為 22.5 s、45.0 s、67.5 s 組 HaCaT 細胞的存活率與正常組比較差異無統計學意義（P>0.05）；UVB 照射 時 間為 90 s、112.5 s、135 s、157.5 s、180 s 和202.5 s組HaCaT 細胞的存活率顯著低于正常組，具有統計學意義（P<0.05），因此本研究選取90 s 作為該實驗的UVB照射時間。見圖1。

圖1 MTT 法測定UVB 照射不同時間后HaCaT 細胞的存活率Fig.1 MTT assay was used to determine survival rate of HaCaT cells for different UVB exposure time

2.2 TLR2和TLR4在UVB致HaCaT損傷中的作用

2.2.1 TLR2 抑 制 劑 C29對 UVB 致 HaCaT 損 傷 的影響 采用濃度分別為 10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmo/lL、75 μmo/lL 和 100 μmo/lL 的 C29處 理HaCaT 細胞2 h后，經UVB 照射，各組細胞存活率均低于正常組，差異具有統計學意義（P<0.05），除正常組外，150 μmo/lL、200 μmo/lL 和 250 μmo/lL 的C29處理 細胞后，經UVB 照射，HaCaT 細胞存活率均高于其他各濃度組，差異具有統計學意義（P<0.05）。C29150 μmo/lL 濃度處理的 HaCaT 細胞，經UVB 照射后，其存活率達103.0%，提示隨著C29濃度的增加，通過抑制TLR2 可逐漸恢復UVB 造成的細胞損傷，其中150 μmo/lL 時可恢復至正常水平，可能由于抑制劑的毒性作用導致細胞損傷，因此確定150 μmo/lL為本實驗的最佳處理濃度。見圖2。

圖2 MTT法測定不同濃度C29處理后HaCaT細胞的存活率Fig.2 MTT assay was used to determine survival rate of HaCaT cells treated with different concentrations of C29

2.2.2 TLR4抑制劑TAK-242對UVB致HaCaT損傷的影響 采用濃度分別為0.01 μmo/lL、0.1 μmo/lL、1 μmo/lL、2 μmo/lL、5 μmo/lL、10 μmo/lL、12 μmo/lL、15 μmo/lL 和 20 μmo/lL 的 TAK-242 處理 HaCaT 細胞2 h后，經UVB 照射，結果顯示HaCaT 細胞的存活率隨 TAK-242 濃度增加而增加，在 2 μmo/lL 時 Ha?CaT 細胞的存活率達到最大為98.9%，隨著TAK-242 濃度的增加，HaCaT 細胞的存活率降低，可能是由于抑制劑濃度過高導致的毒性作用。TAK-242 2 μmo/lL 時的HaCaT 細胞存活率均高于其他濃度組，差異具有統計學意義（P<0.05），提示通過抑制TLR4可逐漸恢復UVB造成的細胞損傷，且2 μmo/lL時效果最好，因此確定2 μmo/lL 為本實驗的最佳處理濃度。見圖3。

圖3 MTT 法測定不同濃度TAK-242 處理后HaCaT 細胞的存活率Fig.3 survival rate of HaCaT cells treated with different concentrations of TAK-242 was determined by MTT assay

2.3 各組細胞Caspase-8表達水平比較 為了進一步探討 TLR2 和 TLR4 在 UVB 對 HaCaT 細胞損傷中的作用機制，是否通過誘導細胞凋亡導致細胞存活率降低，采用Western blot 方法檢測了UVB、UVB+TLR2、UVB+TLR4 及 UVB+TLR2-4 組中細胞凋亡分子Caspase-8的表達。結果如圖4顯示，與UVB 組相比，UVB+TLR2 組Caspase-8 蛋白表達明顯上調（P<0.05）；UVB+TLR4 組 Caspase-8 蛋白表達明顯下調（P<0.05）；UVB+TLR2-4 組 Caspase-8 蛋白表達顯著降低（P<0.01）。說明TLR2 及TLR4 抑制劑聯合應用可能通過抑制細胞凋亡，促進細胞存活。

圖4 Western blot法檢測各組凋亡蛋白Caspase-8表達Fig.4 Western blot was used to detect expression of Cas?pase-8

2.4 TLR2 及TLR4 抑制劑對UVB 導致細胞損傷中氧化應激相關分子NF-κB、p-NF-κB 表達的影響 為了探討氧化應激相關分子NF-κB 的表達參與UVB 引起的HaCaT 細胞損傷過程，采用Western blot方法檢測NF-κB、p-NF-κB 蛋白的表達。結果如圖5所示，與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組、UVB+TLR4 組和 UVB+TLR2-4 組 NF-κB 蛋白表達明顯下調（P<0.05），其中UVB+TLR2-4組NF-κB蛋白表達下調顯著（P<0.05）；UVB+TLR4組下調明顯低于UVB+TLR2組（P<0.05）。與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組 p-NF-κB 蛋白表達明顯上調（P<0.05），UVB+TLR4 和TLR2-4組明顯下調，其中TLR2-4組p-NF-κB蛋白表達下調更加顯著。提示TLR2、TLR4 可能通過NF-κB 信號通路參與UVB 導致的細胞損傷，抑制劑TLR2、TLR4能逆轉該過程。

圖5 Western blot 法檢測各組細胞氧化應激相關蛋白NF-κB和p-NF-κB表達Fig.5 Western blot was used to detect expression of in?flammatory protein NF-κB and p-NF-κB

2.5 TLR2 及TLR4 抑制劑對UVB 導致細胞損傷中內質網應激相關分子IRE1α、PERK、p-PERK 表達的影響 為了探討TLR2、TLR4 是否還可通過影響內質網應激參與UVB 介導的細胞損傷，采用Western blot 檢測了內質網應激相關蛋白IRE1α、PERK、p-PERK 的表達，結果如圖6A 所示，與UVB 組相比，UVB+TLR2組、UVB+TLR4組、UVB+TLR2-4組IRE1α蛋白表達明顯下調（P<0.05），其中UVB+TLR2-4 組IRE1α 蛋白表達下調更加顯著（P<0.05）。如圖6B所示，與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組、UVB+TLR4組、UVB+TLR2-4 組 PERK 蛋白表達明顯下調（P<0.05），其中 UVB+TLR4 組 PERK 蛋白表達下調更加顯著（P<0.05）。如圖 6C 所示，與 UVB 組相比，UVB+TLR2 組 、UVB+TLR4 組 、UVB+TLR2-4 組 p-PERK 蛋白表達明顯下調（P<0.05），其中UVB+TLR2-4 組p-PERK 蛋白表達下調更加顯著（P<0.05），UVB+TLR4 組下調顯著低于 UVB+TLR2 組（P<0.05）。結果提示TLR2、TLR4 可能通過內質網應激途徑參與UVB 導致的細胞損傷，拮抗TLR2、TLR4能逆轉該過程。

圖6 Western blot 法檢測各組細胞內質網應激相關蛋白IRE1α、PERK、p-PERK表達Fig.6 Western blot was used to detect expressions of en?doplasmic reticulum stress-related proteins IRE1α，PERK and p-PERK

3 討論

由于人類活動影響，氮氧空洞不斷擴大，越來越多的UVB 照射到地球上，引起了眾多的疾病。皮膚作為全身最大的器官，又是第一道免疫防線，受到的影響較大。天然免疫在皮膚免疫性疾病、皮膚腫瘤，特別是皮膚炎癥疾病中發揮非常重要的作用，其中由于UVB 導致的皮膚炎癥疾病患者日益劇增引起廣泛的關注。目前研究發現UVB 導致的皮膚炎癥疾病可能與DNA 損傷，促炎癥因子釋放，氧化應激與內質網應激的發生，T 淋巴細胞異常活化等有關。

大量研究表明TLRs 不僅可以識別細菌和病毒的病原體相關分子模式，還可以識別衰老死亡或受損的細胞中的損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活細胞內信號分子的級聯反應，最終實現識別和清除有害物質，從而在免 疫反 應中發 揮重要 作用［9］。 TLR2 和 TLR4 是TLRs家族的一員，二者均是重要的天然免疫受體之一，當有細菌、病毒和真菌等病原體入侵時，以及體內產生的DAMP均可激活TLRs受體，進而促進促炎轉錄因子的表達，例如NF-κB和COX2等［10-14］。還有研究表明，DAMP 模式包括氧化的低密度脂蛋白（oxLDL）和氧化的磷脂（oxPL），可上調NF-κB 表達機制引發NLRP3 炎癥體，通過髓樣分化蛋白-88（MyD-88）依賴途徑，進一步介導 NF-κB 磷酸化入核，調控各種細胞炎癥因子如IL-1、TNF-α 等釋放，誘導細胞凋亡的發生［15-17］。Caspase-8作為細胞凋亡相關蛋白，是細胞凋亡過程中重要的標志分子之一。本實驗采用C29和TAK-242 作為TLR2 和TLR4的抑制劑，實驗發現隨著UVB 照射時間的延長，HaCaT 細胞存活率顯著下降，本研究發現與UVB 組相比，UVB+TLR4 組和 UVB+TLR2-4 組的 HaCaT 細胞內細胞凋亡相關蛋白Caspase-8 和細胞炎癥相關蛋白 NF-κB 表達水平下降，其中 UVB+TLR2-4 組蛋白表達水平下降更加明顯。推測可能是由于UVB照射導致的體內的DAMP 產生增加，通過TLR2 和TLR4信號通路激活下游NF-κB分子，促進炎癥細胞因子的產生增加，從而導致細胞凋亡。本研究結果顯示 TLR2 抑制劑 C29作用后，UVB 處理的 HaCaT 細胞中Caspase-8 和p-NF-κB 表達較對照組升高，分析其原因可能是由于該抑制劑可能作用于細胞內其他信號分子，參與調控細胞損傷的修復作用，且該抑制劑也可能通過影響其他凋亡途徑分子或其他凋亡途徑發揮的抑制凋亡作用，但還需進一步研究證實。

有研究表明，UVB 可誘導產生活性氧ROS 等成分，并對不同細胞成分如細胞核、脂質膜、內質網以及線粒體等產生氧化損傷［18-19］。氧化應激反應可能是皮膚細胞受到UVB 損傷后發生的主要反應，HaCaT 細胞與人類角質層細胞十分相似，可以無限傳代，并且Toll 樣受體在其內均有表達。TLR-2 和TLR-4 是氧化應激中的一個重要受體，參與許多信號通路傳導，因此猜測阻斷這兩個受體相關的傳導通路可能會終止部分氧化應激反應，從而減輕細胞損傷。MISTRY 等［20］研究結果證實，TLR2 和 TLR4抑制劑干預可以明顯減緩氧化應激所致的THP-1巨噬細胞，HEK293T 等細胞凋亡的發生和細胞炎癥因子的釋放。本實驗結果顯示TLR2 和TLR4 抑制劑可降低UVB 導致的細胞損傷，TLR4 抑制劑使用效果明顯優于TLR2 抑制劑，且兩者使用效果更好。這可能是通過抑制TLR-4/MyD-88/NF-κB 絲裂原激活的蛋白激酶和半胱天冬酶途徑的激活，并下調氧化劑的釋放，從而降低了炎癥反應，氧化應激以及凋亡的發生［21］。但還需要進一步研究證實。

UVB 可以導致內質網中未折疊的蛋白積聚和Ca2+失衡。SHIMASAKI 等［22］研究結果表明，通過內質網應激誘導物如毒胡蘿卜素，衣霉素或二硫蘇糖醇會增加上皮細胞TLR2 的表達，還增強了TLR2 配體的反應性，說明內質網應激在調節TLR2 依賴性炎癥反應中起重要作用。本實驗結果表明，West?ern blot 檢測HaCaT 細胞被UVB 照射后內質網應激蛋白表達水平變化顯示，與UVB 組對比，UVB+TLR2 組和 UVB+TLR4 組的 IRE1、PERK 和 P-PERK蛋白表達明顯下降（P<0.05），TLR2-4組蛋白表達下降更加顯著（P<0.05）。通過加入 TLR2 和 TLR4 抑制劑可以明顯降低內質網應激蛋白的表達，說明通過阻斷TLR2 和TLR4 受體通路可以緩解UVB 造成的HaCaT 細胞內質網應激損傷，并且兩種抑制劑一起使用抑制效果更好。

綜上所述，本研究初步證明UVB 可以導致Ha?CaT 細胞發生內質網應激并使細胞發生凋亡，通過阻斷TLR2 和TLR4 信號途徑可緩解UVB 造成的氧化應激和內質網應激損傷，從而可能抑制了UVB 對細胞損傷作用，本研究為以TLR2 及TLR4 為靶點治療UVB 所致皮膚炎癥疾病提供新的思路和實驗依據。