IL-6 介導JAK/STAT 信號通路在膠原誘導性關節(jié)炎大鼠抑郁發(fā)生中的作用機制研究①

楊曉珊 王瑞瑞 李 英 曾祥周 （濱州市人民醫(yī)院風濕免疫科，濱州256610）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關節(jié)進行性骨破壞、侵襲性滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病。由于RA 病程較長、病情遷延、致殘率高，患者易發(fā)生焦慮、抑郁等心理疾病，不僅嚴重降低生活質(zhì)量，還會導致治療中斷，預后不良［1］。目前臨床對RA 伴抑郁相關問題的研究逐漸深入，但其發(fā)病機制尚未被完全闡明。Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活子（Janus protein ty?rosine kinase/signal transducer and activator of tran?scription，JAK/STAT）信號通路是重要的細胞因子信號轉(zhuǎn)導途徑之一，廣泛參與多種疾病病理、生理過程的調(diào)節(jié)，尤其在調(diào)控機體炎癥反應中起重要作用，多種細胞因子如IL-6 均是通過該通路發(fā)揮生物學效應［2-3］。此外，既往報道顯示，RA 伴抑郁患者情緒低落、記憶力及學習能力降低可能與海馬結(jié)構(gòu)損傷、突觸可塑性改變密切相關［4］。另有研究指出，RA、抑郁患者滑膜及海馬組織中均存在大量炎癥細胞浸潤，通過釋放炎癥因子參與疾病進程［5-6］。為此，本研究通過建立膠原誘導性關節(jié)炎（collagen in?duced arthritis，CIA）伴抑郁的大鼠模型，探究IL-6介導JAK/STAT 信號通路在該病進展中的作用及對突觸可塑性的影響，有利于揭示RA 伴抑郁發(fā)病機制，尋找該病新的治療靶點。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 56 只 SPF 級 SD 大鼠，雌雄各半，6 周齡，體重（180±30）g，購自上海中醫(yī)藥大學［許可證號：SYXK（滬）2014-0008］。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）（北京博蕾德生物科技有限公司），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），抗IL-6R 單克隆抗體溶液（麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司），抗體稀釋液（北京諾博萊德科技有限公司），ELISA 試劑盒（上海邦景實業(yè)有限公司），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），BCA 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），兔抗鼠 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 單抗（美國Abcam 公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（北京中山金橋生物技術有限公司）。

EG1150 分體式包埋機、RM2265 病理切片機、DM1000 圖像分析軟件（德國Leica Microsystems 貿(mào)易公司），H7500 電子顯微鏡（日本株式會社日立制作所），DYC-ZY2 轉(zhuǎn)印電泳儀（北京東方瑞利科技有限公司），iBright Imager 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 參照文獻［7］建立CIA 模型大鼠：10 mg 牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L 的冰醋酸中，將此溶液4℃放置過夜后與等體積CFA 均勻混合，配置成牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/ml 的混合溶液。采用注射器反復抽吸至混合溶液充分乳化。大鼠采用0.3 ml/100 g 劑量的水合氯醛麻醉后，取該混合溶液注射于大鼠左足底皮下，0.1 ml/只，壓迫注射位置使混合溶液完全吸收。健康組以生理鹽水代替上述混合溶液，其他操作相同。2 周后左足部、踝關節(jié)發(fā)紅、腫脹，逐漸加重，并蔓延到右后足或前足，提示建模成功。

在CIA建模成功的基礎上采用慢性不可預知法建立CIA伴抑郁模型［8］，用禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、束縛 3 h、4℃ 冰水游泳、45℃ 環(huán)境 5 min、160次/min 水平振蕩30 min 7種方式刺激，第1天從7 種刺激方式中隨機選取1 種，第2 天從剩余6 種方式中隨機選取1 種，直至第7 天以此類推，7 種刺激方式每周各進行1 次，連續(xù)3 周。大鼠出現(xiàn)主動性活動減少、興趣缺失、食欲不振為建模成功。

1.2.2 分組及干預方法 取56 只SD 大鼠，適應性喂養(yǎng)7 d 后隨機選取10 只設為健康組，其余46 只建立CIA 伴抑郁模型。從CIA 建模成功的37 只大鼠中隨機抽取10只設為CIA模型組，其余27只大鼠建立CIA 伴抑郁模型，將CIA 伴抑郁建模成功的22 只大鼠隨機分為CIA 伴抑郁模型組、干預組，各11 只。干預組采用抗白介素-6 受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）單克隆抗體溶液腹腔注射，劑量40 mg/kg，健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組腹腔注射等量抗體稀釋液。干預組、健康組、CIA 伴抑郁模型組自CIA 伴抑郁模型建模成功后1 d 開始干預，CIA 模型組自CIA模型建模成功后1 d開始干預。將健康組、模型組、干預組大鼠分籠飼喂，自由采食、飲水。

1.2.3 血清IL-6 水平測定 經(jīng)抗IL-6R 單克隆抗體溶液干預后12 h，按0.3 ml/100 g 腹腔注射水合氯醛麻醉后，健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組、干預組大鼠腹主動脈取血6 ml。取5 ml 血液2 000/rmin離心15 min（離心半徑12 cm），取上清裝管，保存于-80℃環(huán)境中。采用ELISA 法測定血清IL-6水平，嚴格按照說明書要求操作，并測定450 nm位置吸光光度值，根據(jù)標準曲線計算樣本濃度。

1.2.4 組織取材 取血后立即斷頭處死大鼠，去除顱骨，充分暴露腦組織，掀起兩側(cè)頂葉，將海馬組織分離并取出。以上操作均在冰盤中進行，并于3 min 內(nèi)完成。各組取5 只海馬組織放置于40%中性甲醛溶液中備用，另取5 只海馬組織放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 海馬組織病理變化、突觸界面結(jié)構(gòu)觀察取40%中性甲醛溶液固定的海馬組織，流水沖洗30 min，常規(guī)乙醇脫水、石蠟包埋，以病理切片機制作成厚度為5 μm連續(xù)切片，HE染色，采用顯微鏡觀察海馬組織病理變化，并采用電子顯微鏡隨機攝片（放大20 000 倍），經(jīng)圖像分析軟件參考CLIFTON等［9］方法測量海馬神經(jīng)元突觸活性區(qū)長度、突觸后致密物厚度（postsynaptic dlensity，PSD）。測量示意圖見圖1。

圖1 突觸活性區(qū)長度、PSD測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of measuring length of synaptic active area and PSD

1.2.6 海馬組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量測定 取保存于-80℃環(huán)境中的海馬組織，剪碎后加入預冷生理鹽水進行勻漿，與0.5 ml RIPA 細胞裂解液混合后進行冰上裂解，10 000/rmin離心15 min（離心半徑為8 cm）取上清，經(jīng)BCA 試劑盒進行蛋白定量。取30 μg樣品與等體積上樣緩沖液混勻，配制10%分離膠行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳凝膠進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加入封閉液，室溫下?lián)u床孵育2 h，加入稀釋一抗（1∶1 000），4℃ 孵育過夜，TBST 漂洗3 次，加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（1∶10 000），常溫孵育2 h，TBST 漂洗3 次。暗室中顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，分析灰度值，以 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin 灰度值表示蛋白相對表達量。計算p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，多樣本計量資料以方差分析檢驗，兩兩樣本以LSD-t分析檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 健康組毛發(fā)柔順、光亮，活力旺盛，進食、進水及關節(jié)活動正常，CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組左足部發(fā)紅、腫脹，逐漸加重，且蔓延至右后足或前足，關節(jié)難以負重，少數(shù)發(fā)生潰瘍、紅斑，CIA 伴抑郁模型組除具有CIA 模型組表現(xiàn)外，另表現(xiàn)為呆滯少動、食欲不振、體重減輕，干預組經(jīng)過干預上述表現(xiàn)有所改善。

2.2 各組血清IL-6 水平比較 健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組、干預組血清IL-6 水平分別為（32.82±9.16）pg/ml、（85.23±11.30）pg/ml、（102.62±21.54）pg/ml、（57.43±8.91）pg/ml，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=51.071，P<0.001）；CIA 模型組血清 IL-6 水平高于健康組（t=11.394，P<0.001），CIA伴抑郁模型組高于CIA模型組、健康組（t=2.280，P=0.034；t=9.480，P<0.001）；干預組低于CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組（t=6.292、6.430，P<0.001），高于健康組（t=6.238，P<0.001）。

2.3 各組海馬組織病理變化情況 通過觀察HE染色結(jié)果，健康組神經(jīng)元細胞為橢圓形，胞體飽滿、胞質(zhì)豐富，細胞核圓且大，邊緣清晰；CIA 模型組細胞層次減少，結(jié)構(gòu)模糊，細胞帶變稀、紊亂、中斷，部分神經(jīng)元細胞發(fā)生核固縮、核深染變化，部分細胞核變小或消失；與CIA 模型組比較，CIA 伴抑郁模型組神經(jīng)元細胞病變更為明顯；干預組細胞發(fā)生一定程度萎縮，排列較為規(guī)則，神經(jīng)元細胞膜較為完整，少部分細胞萎縮、核固縮。見圖2。

圖2 各組海馬組織病理變化情況（HE染色，×400）Fig.2 Pathological changes of hippocampus in each group（HE staining，×400）

2.4 各組海馬突觸界面結(jié)構(gòu)變化 電鏡觀察顯示，健康組突觸結(jié)構(gòu)清晰、完整，數(shù)量多，囊泡均勻且豐富；CIA 模型組突觸結(jié)構(gòu)部分溶解，界限較為清晰，突觸囊泡多；CIA 伴抑郁模型組突觸結(jié)構(gòu)溶解、界限模糊，突觸前膜、后膜均不明顯，突觸小泡破裂或融合；干預組突觸數(shù)量較CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組增加，結(jié)構(gòu)較為清晰，突觸間隙縮小，囊泡多。見圖3。

圖3 各組海馬突觸超微結(jié)構(gòu)變化（×20 000）Fig.3 Changes in ultrastructure of hippocampal synapses in each group（×20 000）

2.5 各組海馬突觸可塑性比較 海馬突觸PSD、活性區(qū)長度組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CIA 模型組PSD、活性區(qū)長度均小于健康組，CIA 伴抑郁模型組小于CIA 模型組、健康組，干預組大于CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組，小于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組海馬CAI區(qū)突觸可塑性比較（，nm）Tab.1 Comparison of synaptic plasticity in hippocampal CAI area in each group（，nm）

表1 各組海馬CAI區(qū)突觸可塑性比較（，nm）Tab.1 Comparison of synaptic plasticity in hippocampal CAI area in each group（，nm）

Note：Compared with healthy group，1）P<0.05；compared with CIA model group，2）P<0.05；compared with CIA with depression model group，3）P<0.05.

Active zone length 335.95±52.67 249.75±35.511）201.63±42.851）2）283.36±35.491）2）3）8.967 0.001 Groups Healthy CIA model CIA with depression model Intervention n5 5 5 5 F P PSD 71.25±9.46 51.67±6.891）40.38±5.121）2）62.87±7.031）2）3）16.975<0.001

2.6 各組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較 海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CIA模型組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均高于健康組，CIA伴抑郁模型組高于CIA模型組、健康組，干預組低于CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組，高于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2、圖4。

表2 各組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量比較（）Tab.2 Comparison of relative expression levels of p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 protein in hippo?campus in each group（）

表2 各組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量比較（）Tab.2 Comparison of relative expression levels of p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 protein in hippo?campus in each group（）

Note：Compared with healthy group，1）P<0.05；compared with CIA model group，2）P<0.05；compared with CIA with depression model group，3）P<0.05.

p-STAT3/ STAT3 0.21±0.05 0.50±0.071）0.85±0.081）2）0.35±0.051）2）3）92.873<0.001 Groups Healthy CIA model CIA with depression model Intervention n5 5 5 5 F P p-JAK2/ JAK2 0.24±0.04 0.52±0.061）0.79±0.081）2）0.39±0.041）2）3）82.475<0.001

圖4 海馬組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印跡圖Fig.4 Immunoblot map of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein in hippocampus

3 討論

RA 是一種慢性致殘性自身免疫系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為進行性、對稱性多關節(jié)炎，最終導致關節(jié)畸變、功能喪失，嚴重影響患者身心健康，甚至引發(fā)抑郁癥等心理疾患［10］。目前臨床在治療RA 伴抑郁時以藥物治療、心理治療及聯(lián)合治療為主，可在一定程度上減輕患者癥狀，但用藥周期長，患者常因依從性不足而中斷或放棄治療，整體療效不佳［11］。近年來，隨著針對信號轉(zhuǎn)導通路、免疫細胞、促炎因子等分子靶向治療方式的出現(xiàn)，RA 伴抑郁的治療已邁向靶向治療時代。RA 伴抑郁病變組織以自分泌、旁分泌方式釋放大量細胞因子，從而介導蛋白質(zhì)水解、細胞增殖、炎癥免疫，參與滑膜及海馬組織病變過程。由于絕大部分細胞因子為糖蛋白或多肽，須結(jié)合靶細胞表面對應受體，激活相應的信號通路方可具有生物學效應，因此，RA 伴抑郁中細胞因子介導的信號轉(zhuǎn)導通路已成為研究熱點。

本研究顯示，HE 染色結(jié)果中干預組細胞發(fā)生一定程度萎縮，與CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組比較，細胞變化不明顯，提示下調(diào)IL-6 可改善RA 伴抑郁大鼠海馬組織病理變化；電鏡觀察干預組突觸數(shù)量較CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組增加，結(jié)構(gòu)較為清晰，突觸間隙縮小，囊泡多，提示下調(diào)IL-6 可改善海馬突觸界面結(jié)構(gòu)變化；健康組、干預組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組的PSD、活性區(qū)長度依次減小，提示下調(diào)IL-6 可減輕突觸可塑性損傷。突觸是連接神經(jīng)元、傳遞神經(jīng)信息的關鍵部位，也是神經(jīng)可塑性變化的敏感結(jié)構(gòu)。突觸可塑性變化是突觸形態(tài)、功能的改變，目前通常以PSD、活性區(qū)長度、間隙寬度及界面曲率等突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)作為反映突觸可塑性變化的敏感指標［12-13］。IL-6 是由活化T 細胞、單核/巨噬細胞分泌的糖蛋白，可結(jié)合可溶性IL-6R 誘導分泌血管內(nèi)皮生長因子，促使內(nèi)皮細胞增殖、遷移，導致血管翳形成，在RA 骨與軟骨破壞、關節(jié)滑膜炎中具有重要作用［14］。IL-6在RA機體中處于高表達狀態(tài)，可進一步促使腦部膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元釋放激素及神經(jīng)化學物質(zhì)，并激發(fā)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素對下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)節(jié)作用參與抑郁癥發(fā)生、發(fā)展。LI 等［15］研究認為，RA 患者的血清IL-6 水平顯著高于健康受試者，RA伴抑郁患者則更高，且血清IL-6水平與抑郁程度呈正相關。本研究通過對CIA伴抑郁模型大鼠注射抗IL-6R 單克隆抗體溶液，海馬組織病理變化及突觸界面結(jié)構(gòu)變化減輕，PSD、活性區(qū)長度增大，表明下調(diào)IL-6 可減輕海馬組織及突觸界面結(jié)構(gòu)變化、突觸可塑性損傷。

此外，本研究中，健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3依次升高，提示在RA、RA 伴抑郁發(fā)病過程中JAK/STAT 信號通路處于激活狀態(tài)，經(jīng)IL-6R 抗體干預后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 較 CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組降低，但仍低于健康組，說明下調(diào)IL-6 后可能進一步抑制JAK/STAT 信號通路，發(fā)揮減輕RA伴抑郁突觸損傷作用。JAK2屬于非跨膜型酪氨酸激酶JAK 家族成員，可介導細胞增殖、免疫功能、造血等多種細胞因子生物學活性，通過結(jié)合跨膜細胞因子受體，誘導受體二聚化，啟動JAK2 激酶磷酸化，隨后招募STAT3，催化STAT3 發(fā)生磷酸化［16-17］。活化的STAT3蛋白進入細胞核中結(jié)合DNA靶序列，對相應基因表達進行調(diào)節(jié)，介導細胞因子自胞外向胞內(nèi)傳遞的過程。IL-6 與IL-6R 復合物結(jié)合于公共轉(zhuǎn)導子gp130 后，可促使與IL-6 偶聯(lián)的JAK2 激酶互相聚集并磷酸化，從而發(fā)揮生物學功能。TIAN 等［18］通過基因沉默技術使 JAK/STAT 信號通路失活，結(jié)果顯示抑郁模型大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達上調(diào)，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡，減輕抑郁癥狀，綜合兩項研究提示可通過阻斷JAK/STAT 信號通路減輕抑郁病情。本研究表明IL-6 通過激活JAK/STAT 信號通路，參與調(diào)控RF 伴抑郁炎癥反應發(fā)生、發(fā)展，推測針對性阻斷JAK/STAT 信號通路可達到減輕抑郁病情的目的。

綜上所述，IL-6 介導JAK/STAT 信號通路參與RA 伴抑郁進展過程，推測下調(diào)IL-6 阻斷JAK/STAT信號通路可改善海馬組織病理變化及海馬突觸界面結(jié)構(gòu)變化，減輕突觸可塑性損傷。以IL-6 介導JAK/STAT 信號通路為靶目標可能為RA 伴抑郁的治療提供新思路。