蛋白酶體抑制劑MG132改善膠原誘導性關節炎模型大鼠炎癥反應的研究①

蹇孝麗 師 萍 周 艷 馮琳琳 蔣紅梅 （貴州醫科大學醫學檢驗學院，貴陽550004）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，常引起關節不可逆損傷，進而導致關節功能障礙［1］。有研究顯示RA 患者血清及滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6 表達水平升高，而IL-4、IL-10 等抑炎因子表達水平降低，且這些炎癥因子的異常表達與關節長期遭受破壞密切相關［2-3］。因此，平衡RA 患者體內促炎因子與抑炎因子的表達可能是治療RA的一種有效措施。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome path?way，UPP）是一種蛋白質選擇性降解的主要途徑，可參與到細胞周期、細胞凋亡、炎癥反應、細胞內信號傳導等過程［4］。最近研究顯示UPP 參與多種疾病的炎癥反應過程，并在其中發揮非常重要的作用，抑制UPP 途徑的活性可能會改善某些疾病的炎癥反應［5-6］。MG132是一種蛋白酶體抑制劑，屬于醛基肽類，有研究報道MG132 可以減輕多種疾病的炎癥反應，并減少相關炎癥因子的產生［6-8］。目前關于UPP在RA 相關炎癥反應過程中的研究報道較少，本研究以牛Ⅱ型膠原構建膠原誘導性關節炎（collageninduced arthritis，CIA）模型大鼠，通過注射蛋白酶體抑制劑MG132 進行干預，旨在觀察MG132 對CIA 大鼠關節病理改變、血清炎癥相關因子TNF-α、IL-6 和IL-10表達水平的影響，討論蛋白酶體抑制劑MG132在膠原誘導性關節炎大鼠炎癥反應中的作用，為臨床用藥和基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雌性SD 大鼠48 只，購自重慶動物中心，體重約190 g，適應性飼養1 周后開始實驗。

1.1.2 主要試劑及儀器 牛Ⅱ型膠原（BIIC，批號：C7806）和弗氏完全佐劑（FCA，批號：F5881）購自Sigma 公司；MG132（批號：S2619）購自Selleck 公司；大鼠 TNF-α ELISA 試劑盒 96t（批號：ERC-102a）購自欣博盛生物科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA 試劑盒96t（批號：JRE-04）購自安徽巧伊生物科技有限公司；大鼠IL-10 ELISA 試劑盒96t（批號：BMS629）購自eBioscience 公司；恒溫水浴鍋ELX800 酶標儀購自Bio-Tek。

1.2 方法

1.2.1 建立關節炎模型 將適應性飼養1 周的48 只 SD 大鼠隨機分為 3 組，即對照組、CIA 模型組和MG132干預組，每組16只。參考課題組此前建模方法建立CIA 大鼠模型［9］：將牛Ⅱ型膠原溶液與FCA等體積混合，乳化成混懸乳劑，取200 μl多點注射于大鼠左后足跖部皮內。加強免疫于尾根部同法注射膠原乳劑，在初次免疫后第14天進行。對照組大鼠同法注射相同劑量生理鹽水。

1.2.2 MG132干預過程 用一定劑量的二甲基亞砜（DMSO）溶解MG132，使MG132最終濃度為5 mg/ml，置于-20℃冰箱備用。在造模后第21 天，以皮下注射方式注射 MG132 進行干預，劑量為 1 mg/kg［9］，每天1 次，連續注射14 d。其余兩組大鼠注射相同劑量的溶媒劑DMSO。在造模第42 天，即給予MG132干預后隔1 周，處死大鼠采血并分離關節滑膜組織做相應檢測。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 一般情況觀察 觀察各組大鼠在用牛Ⅱ型膠原造模前后MG132 干預前后關節紅腫情況、毛色變化、進食情況、精神活動狀態及排泄物和體重等變化。

1.2.3.2 關節炎指數 分別在初次免疫后第7、14、21、28、35 及 42 天觀察各組大鼠四肢足趾關節、跖關節和踝關節的腫脹情況。并根據各關節炎癥情況進行關節炎指數（arthritis index，AI）評分。

1.2.3.3 關節病理觀察 取左后肢剔除表面皮膚和肌肉組織，保留踝關節及滑膜組織，固定于10%的中性甲醛中1 d，12.5%EDTA-2Na 脫鈣，制作石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察踝關節軟骨的增生和破壞情況、滑膜組織增生及炎癥情況。

1.2.3.4 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的水平 操作步驟按照試劑盒說明書進行，各細胞因子的濃度通過繪制標準曲線計算得出。

1.3 統計學處理 數據分析使用R 統計分析軟件（version 3.2.1）。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及關節炎指數的變化 對照組大鼠飲食正常、活動良好、反應迅捷、毛色光澤。注射牛Ⅱ型膠原后第7 天，CIA 模型組大鼠注射足開始緩慢出現紅腫變化，并慢慢累及鄰近和其他足關節，第14天加強免疫后隨著時間的推移關節炎癥狀進展較快并逐漸加重，第21天關節紅腫更加明顯。隨著時間的延長有些大鼠伴有行動遲緩、跛行以至活動障礙。MG132 干預組大鼠造模成功后，第21 天觀察大鼠出現明顯關節炎相關癥狀后再經皮下注射MG132 干預2 周；經干預后的大鼠關節腫脹程度較對照組有所減輕，且干預組大鼠較少出現關節功能障礙和行動遲緩等嚴重情況。見圖1。

通過動態比較3組大鼠關節炎指數，造模第7天，CIA模型組和MG132干預組大鼠較對照組關節炎指數開始升高，第21天達到高峰。干預組經MG132干預后，關節炎指數明顯下降，在建模第42天，該指數明顯低于CIA模型組（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠足趾關節觀察及關節炎指數（AI）的比較Fig.1 Observation of toe joints and comparison of arthri?tis index（AI）

2.2 大鼠關節滑膜組織病理改變 對照組大鼠可見清晰的關節腔，關節軟骨表面光滑，滑膜組織可見排列整齊的滑膜細胞和滑膜下組織，無炎癥細胞浸潤（圖2A）。CIA 模型組大鼠關節內纖維組織增生、關節腔變狹窄、關節軟骨破壞、關節面粗糙、周圍可見大量新生血管和炎癥細胞、滑膜組織細胞明顯增厚（圖2B）。MG132干預組大鼠關節損壞較輕、軟骨破壞較少、滑膜組織細胞增生較輕、只見少量炎癥細胞（圖2C）。

圖2 各組大鼠關節組織病理特征（HE染色，×200）Fig.2 Histological characteristics of ankle joints of rats（HE staining，×200）

2.3 大鼠血清炎癥相關因子TNF-α、IL-6、IL-10 水平的比較 與對照組相比，CIA 模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 的含量明顯增高（P<0.01），IL-10 的含量明顯減少（P<0.01）。與CIA 模型組比較，MG132干預組血清 TNF-α、IL-6 的含量顯著降低，IL-10 的含量顯著增高（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量的比較（，n=16）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 contents of serum in rats（，n=16）

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量的比較（，n=16）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 contents of serum in rats（，n=16）

Note：Compared with Mock group，1）P<0.01；compared with Collagen group，2）P<0.01.

Groups Mock Collagen MG132 intervention TNF-α（pg/ ml）56.24±10.27 86.48±24.801）50.82±11.122）IL-6（pg/ ml）53.69±10.05 138.72±62.571）68.12±17.842）IL-10（pg/ ml）123.28±42.50 76.49±29.811）113.76±40.622）

3 討論

本研究結果顯示蛋白酶體抑制劑MG132 可以明顯減輕牛Ⅱ型膠原誘導性關節炎模型大鼠關節腫脹癥狀，減少關節組織炎癥細胞浸潤，降低大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6 表達水平，升高血清中抑炎因子IL-10表達水平。

RA 的病理特征主要是慢性的關節滑膜炎癥和纖維組織增生，長期嚴重的炎癥反應會使關節破壞，最終導致殘疾［1］。研究顯示RA患者關節滑膜內大量炎癥細胞浸潤和血管翳的形成，都與細胞因子失調，主要是促炎因子和抑炎因子表達異常有關［10］。之前的研究顯示，RA 患者體內的 TNF-α 與IL-6 活性水平呈明顯升高趨勢。TNF-α 及 IL-6 是重要的促炎因子，可參與活化單核巨噬細胞、成纖維細胞等，對RA 患者病程進展起到加重的作用，其血清表達水平與患者的嚴重程度呈正相關關系［11-12］。本研究結果亦顯示CIA模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6表達水平與對照組比較顯著升高。與TNF-α和IL-6 不同，IL-10 是一種抑炎因子，其能抑制某些細胞因子如 TNF-α、IL-6 及 IL-8 的活性，還能抑制軟骨細胞和滑膜成纖維細胞中 IL-1 和 TNF 的表達［13］。本研究結果顯示CIA 模型組大鼠血清中IL-10 表達水平與對照組相比顯著降低。

長期的炎癥反應是導致RA 進展及惡化的主要原因，因此控制炎癥反應在治療RA 中顯得極為重要。目前雖有抗風濕藥、非甾體抗炎藥等用來治療RA，但這些藥物的治療效果有限［14］。泛素-蛋白酶體途徑作為細胞內重要的蛋白質降解途徑，亦可調控炎癥相關蛋白，在炎癥反應過程中充當著極為重要的角色［15-16］。在調控多種炎癥基因表達的過程中，NF-κB是最為重要的轉錄因子，經各種因素刺激活化后可以增加多種炎癥因子如TNF-α、IL-6、環氧化酶等的表達，而增加的這些炎癥因子又能進一步活化NF-κB，導致整個炎癥過程反復進行并加重［17］。抑制NF-κB 的激活可以降低炎癥因子的釋放，從而改善RA 的炎癥反應［18］。研究顯示蛋白酶體抑制劑MG132 可通過抑制NF-κB 的活化及轉錄以減輕分枝桿菌及佐劑誘導的關節炎大鼠的炎癥疼痛反應［19］。本課題組前期研究結果亦顯示蛋白酶體抑制劑MG132 可以通過減少IκB 蛋白的降解，使NF-κB 無法與結合蛋白 IκB 解離從而抑制 NF-κB 的活性，減輕RA大鼠的炎癥反應［9］。

本實驗在前期研究基礎上，用蛋白酶體抑制劑MG132 對CIA 模型大鼠進行干預，進一步檢測大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6 和抑炎因子IL-10 的表達水平。結果顯示，在MG132 干預后，大鼠血清中TNF-α 和IL-6 表達水平顯著下降，關節受累現象也得到明顯改善，而IL-10 水平明顯升高。促炎因子TNF-α、IL-6 表達水平主要受 NF-κB 通路調控，MG132 可能是通過抑制NF-κB 的活化和轉錄從而降低相關炎癥因子TNF-α、IL-6 的表達；但其升高IL-10水平的機制有待進一步探討。

綜上所述，本研究顯示蛋白酶體抑制劑MG132能有效降低 CIA 大鼠 TNF-α、IL-6 表達水平，同時提高IL-10 表達水平，對改善CIA 大鼠炎癥癥狀，緩解疾病的進一步發展起到積極作用。