菊花再生體系建立的探討

鄧如杰

（廣東省懷集縣林業技術推廣中心，廣東 肇慶 526400）

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）原產地在中國，又名黃華、壽客、金英、秋菊、陶菊、隱逸花、家菊、日精、女華、延年，屬菊科，是多年生宿根草本或亞灌木植物。菊花的品種繁多，色彩多樣，花型變化很大，香、姿、韻俱佳，入我國傳統四大名花之列，屬當代中國十大名花之一，深受國內和國外的關注和喜愛。目前，中國栽培的菊花品種約3000個。菊花生長旺盛，萌發能力較強，一朵菊花可以經過多次摘心，分生出上千上萬個花蕾。部分菊花品種的枝條較多而且柔軟，可以組成菊門、菊籬、菊亭、菊橋、菊球、菊塔等形式精美的造型。

菊花育種是從株高、花期、花色、抗性和花型等多方面對菊花進行改良。由于菊花的病毒種類比較多，而且危害較為嚴重，使用傳統的扦插繁殖苗，容易引起病毒的蔓延。因此，運用脫毒培養和組培快繁生產母本植株的技術，對優良品種的脫毒和復壯起著重要作用。本研究以菊花為材料，從6-BA、NAA組合和配比、不同部位的外植體等方面來探討并建立供試菊花的再生系統，對影響菊花再生系統的因素進行詳細地研究。

1.材料和方法

1.1 植物材料：菊花無菌試管苗

1.2 試劑及儀器設備

1.2.1 試劑

NAA 、6-BA：SIGMA 公司

NAA：1 mol/L NaOH溶解，終濃度為0.5 g/L，4℃保存備用；

6-BA：少量1mol/LHCl溶解，終濃度為0.5g/L，4℃保存備用。

其他常規的化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2.2 儀器設備

超凈工作臺（蘇凈集團）

自動高壓滅菌鍋（Yamato Sterilizer SM510）

20μL、200μL、1mL 移液槍（Gilson）

1.3 基本培養基

植物組織培養基：實驗中以MS(Murashige and Skoog 1962)為基本培養基，瓊脂7-8g/L，滅菌前調pH到5.8－5.9。

1.3.1 誘導與分化培養基

以MS為基本培養基，配加不同濃度的6-AB和NAA，其中6-BA取0、1、2、3、4mg/L五水平，NAA取0、0.1，0.2，0.3，0.4mg/L 五水平。

1.3.2 生根培養基

以1/2MS為基本培養基，配加不同濃度的NAA（0、0.1、0.2mg/L）。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養條件

溫度25士1℃，光照強度2000－2400 lx，光照時間為16h/d。

1.4.2 外植體的選擇

選取約25天苗齡的菊花無菌苗葉片（取充分展開的中上部幼嫩葉片）、莖段（取莖段的兩節之間部位）、葉柄（取中上部幼嫩葉的葉柄）和根段（取15天苗齡的無菌苗幼嫩根段）為外植體。接種至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L分化培養基上。每7天觀察不同外植體的生長情況，并于35天后統計不同外植體平均再生芽數。

1.4.3 不同濃度6-BA和NAA對誘導芽的影響

為了探索適合菊花不定芽再生的最佳配方，本實驗以MS為基本培養基，配加6-BA、NAA兩種激素，激素配比見表1。以20－25天苗齡的經過滅菌的無菌苗中上部的幼嫩葉片為外植體，切成0.5×0.5cm，葉背靠近培養基接種在不同種類的培養基上，每瓶接種5塊外植體，每個處理6瓶，觀察并記錄實驗結果。

表1 6-BA和NAA的不同濃度配比

3 2 0.2 4 3 0.2 5 4 0.2 6 1 0.3 7 2 0.3 8 3 0.3 9 4 0.3 10 1 0.4 11 2 0.4 12 3 0.4 13 4 0.4 14 1 0.5 15 2 0.5 16 3 0.5 17 4 0.5

1.4.4 不同濃度NAA對生根的影響

將菊花無菌苗切取為1－1.5cm長，接種到NAA不同濃度的生根培養基中（以1/2MS為基礎，添加不同濃度的NAA），NAA濃度見表2。15天后比較新生菊花苗生根的情況，并統計結果，從而篩選出適合供試菊花組織培養的最佳生根培養基。

表2 不同NAA濃度表

1.4.5 光照對愈傷組織產生與不定芽再生的影響

以葉片作為外植體，接種到MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L培養基上，分別放置在光照（16h/d）和黑暗處培養，觀察結果。

2.結果與分析

2.1 不同外植體不定芽再生能力的比較

在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L的培養基中，均觀察到葉片、莖段、葉柄具有分化現象發生，而根段沒有任何分化現象發生，具體生長狀況見表3。

表3 不同外植體不定芽再生能力比較表

通過對不同外植體產生不定芽再生能力的比較，可知來源于不同組織或器官的外植體有不同的分化能力。當細胞分裂素與生長素共同使用時能刺激愈傷組織的形成，而實驗使用的激素不適合根段的愈傷組織的形成，所以根段沒有觀察到任何分化現象發生，具體再生芽數見表4。根據結果可以得出：葉片最適合作為外植體。

表4 不同外植體產生再生芽的比較

2.2 不同濃度6-BA和NAA對誘導芽的影響

葉盤接種到所設計的培養基上，從第4天開始，可以不同程度看到葉盤膨大。20天后，誘導芽陸續地產生。培養30天，觀察并統計長度均在5毫米以上芽的數量，芽的誘導率及生長情況見表5。

表5 不同濃度6-BA和NAA對誘導芽的影響

結果表明，激素濃度的不同，對菊花葉片叢生芽的產生有著不同的影響。在沒有添加任何激素的培養基上，沒有芽的產生；在添加不同濃度6-BA和NAA的培養基上，都有叢生芽的產生。6-BA對叢生芽的生長質量有很大影響，當6-BA的濃度為1mg/L時，幼苗節間長，瘦弱；當6-BA的濃度上升為2mg/L時，幼苗的質量明顯得到改善，幼苗濃綠、節間短、粗壯；當6-BA的濃度上升為4mg/L時，就表現出萎縮或褐化等不良的癥狀，7d后接種材料就開始褐化。高亦珂（2001）和李辛雷等（2004）對菊花莖葉外植體再生體系進行研究時，也有類似的結果。在激素濃度偏高的情況下，葉片與莖段易褐化、壞死。當NAA的濃度為0.1mg/L時，產生的叢生芽較少；當NAA的濃度增加到0.3mg/L時，產生叢生芽的數量會明顯增多，但如果濃度增加到0.5mg/L時，叢生芽的產生數量又會減少，說明濃度過高具有一定的抑制作用。李辛雷等（2004）也報道了NAA濃度升高時，叢生芽誘導率下降。在不同濃度6-BA和NAA配比的培養基上，幾種典型的生長狀況如圖1。根據實驗結果確定，適合誘導菊花叢生芽再生的最佳培養基為MS+6-BA2.0mg/L +NAA0.3mg/L。

圖1 不同濃度6-BA和NAA配比對外植體的影響

2.3 不同濃度NAA對生根的影響

將菊花無菌苗切取為1－1.5cm長，接種于不同濃度NAA的生根培養基中，15天后統計長度超過0.5cm的根數量，結果見表6。從結果可以看出，在1/2MS培養基中，無論是否添加NAA都能誘導根的產生，在沒有添加激素的條件下，根的生長狀況良好，數量多、長而粗，并且有大量的根毛（如圖2）。實驗說明NAA對根的誘導效果并不明顯，稍高濃度的NAA對根的生長還起到抑制作用，不添加NAA的1/2MS培養基更適合誘導根的生長。

表6 不同濃度NAA對生根的影響

圖2 不同濃度NAA對生根的影響

2.4 光照對愈傷組織產生與不定芽再生的影響

光照對愈傷組織產生與不定芽再生有很大的影響，在光照條件下（16h/d）培養的外植體會迅速增大，呈綠色，而且只有切口處產生愈傷組織，由此再生出來的不定芽較少，長勢不均。而將外植體先在黑暗處培養10d，整個外植體都會產生愈傷組織，呈淡黃色，上面有大量的凸狀物，再轉移到光照條件下培養，凸狀物變成綠點，長成大量的不定芽，由此產生的不定芽數量多、長勢均一（如圖3）。這說明在黑暗處培養更利于愈傷組織的產生及不定芽的再生。

圖3 光照對愈傷組織產生與不定芽再生的影響

3.結論與討論

3.1 影響葉片外植體不定芽再生的因素

不同的培養條件和外植體生理狀態，對葉片的再生能力有很大的影響。葉片在含高濃度NAA的培養基上進行一定的誘導培養后再轉接到低濃度NAA的培養基上能夠正常生長，說明濃度較高的NAA有利于誘導葉片外植體的生長。

不同部位及生理狀態的葉片再生能力也不同。其中15－25天苗齡的無菌苗中上部幼嫩葉片再生能力較強。組織的幼嫩程度與形態發生能力和植株分化能力有關，幼嫩葉片組織分化程度淺，容易受外界條件的影響而改變發育和分化方向。在外源激素存在的條件下，幼嫩的組織容易脫離原來的分化方向而再生不定芽。

不同組織器官的材料有不同的分化能力，從2.1可以看出：葉片與莖段分化能力較強，而根的分化能力較弱。

3.2 影響葉片外植體褐化和再生率的因素

不適宜的培養基，可能誘導外植體分泌某些容易引起褐化的物質，或外植體不能進行正常的新陳代謝而導致褐化，適宜的培養基對防止葉片外植體褐化很重要。實驗中觀察到在不適宜的培養基中葉片外植體明顯的褐化現象出現在接種后約15d。無菌苗上部的幼嫩葉片出現褐化的時間比中下部晚，或褐化程度略低于下部老葉，再生率相對較高。中下部葉片再生率低，下部葉基本沒有芽再生。所有葉片外植體都隨培養時間的延長都會出現褐化現象。不同器官的外植體也影響葉片的褐化和不定芽再生。

3.3 最佳再生體系的確立

葉片接種在MS +6-BA2.0mg/L + NAA 0.3mg/L培養基上，一星期左右有愈傷組織的產生，再經過約20天的培養，愈傷組織分化出不定芽，并且芽的誘導率達100%，再生芽在1/2MS培養基上經過10天左右的培養可誘導出根，生根率為100%。再過20天即可煉苗、移栽。