Th22細胞及miR-200a在肝纖維化小鼠模型中的表達▲

盧東紅 姜海行 胡榜利 周 霞 陶 霖 盧東誠 阮仙仙

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科，廣西南寧市 530021)

肝纖維化是各種慢性致病因素所致慢性肝損傷后，由于組織發生修復反應時外基質合成、降解和沉積不平衡而引起的病理過程。輔助性T細胞22(T helper cells 22,Th22) 是新發現的效應CD4+T 細胞亞群，參與多種免疫疾病的發生發展，它為治療慢性皮膚炎癥以及哮喘等提供了新的思路。有研究發現微小RNA-200a(micro RNA-200a，miR-200a)在肝纖維化、肝硬化及肝癌中的表達下調，但關于miR-200a與Th22細胞相互關系的報道甚少。本研究通過建立四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導肝纖維化模型，并檢測肝纖維化小鼠脾臟Th22 細胞表達水平及肝纖維化小鼠肝組織IL-22和miR-200a的表達量，初步探討Th22細胞及miR-200a在肝纖維化發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體的雄性BALB/c小鼠(8周齡)，體重約25 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供；CCl4和橄欖油購自上海國藥集團化學試劑有限公司；RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國 GIBCO 公司；乙酸肉豆蔻佛波醇和離子霉素購自美國Sigma公司；大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體購自美國 BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型的建立 將40只雄性BALB/c小鼠按隨機數字表法分為對照組和模型組，每組20只。采用CCl4腹腔注射法建立小鼠肝纖維化模型。對照組腹腔內注射橄欖油，2 mg/kg，2次/周；模型組腹腔內注射CCl4溶液(橄欖油配制)，濃度20%，2 mg/kg，2次/周。兩組小鼠分別于8周后處死， 留取脾和肝臟。

1.2.2 肝組織HE和Masson染色 取肝臟后立即放入4%甲醛溶液中固定，24 h內制成蠟塊。蠟塊切片，常規HE和Masson染色，光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白表達的檢測 采用免疫組化SP法：切片、脫蠟、水化、抗原修復、一抗4 ℃過夜、二抗溫育、DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片、鏡檢。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統半定量測定α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，計算平均光密度值，取同一標本三張切片測量值的均值。

1.2.4 流式細胞術檢測小鼠脾臟 Th22細胞 取下小鼠脾臟置于PBS緩沖液中剪碎、研磨，制成脾單細胞懸液。用紅細胞裂解液裂解紅細胞，用RPMI 1640完全培養基(含10%胎牛血清)調整淋巴細胞濃度為1×106/mL，以24孔板作培養載體，加入PMA(25 ng/mL)、離子霉素 (1 μg/mL)和蛋白質轉運抑制劑 (1.7 μg/mL)，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育5 h。收集細胞，進行細胞表面CD4分子染色，破膜劑破膜后加AF488-IFN-γ抗體、APC-IL-17抗體和PE-IL-22抗體，向相應對照管內加同型對照抗體，4 ℃避光孵育30 min，用1%多聚甲醛避光固定，24 h內用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。結果采用Flowjo 7.6.1軟件進行分析。IL-22+IL-17-IFN-γ-CD4+定義為Th22細胞。

1.2.5 RT-PCR檢測肝組織IL-22和miR-200a mRNA的表達 肝臟組織取材后保存于-80 ℃冰箱。以TRIZOL試劑提取肝組織總RNA，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，放-20 ℃冰箱保存。實時熒光定量PCR擴增IL-22和miR-200a mRNA，以β-肌動蛋白作為內參照基因。IL-22引物序列：F-CGA TTG GGG AAC TGG ACC TG，R-GGA CGT TAG CTT CTC ACT TT；miR-200a引物序列：F-CCT ACG CCA CCA TTA ACA AGC C，R-GCC GTC TAA CAC TGT CTG GTA；β-肌動蛋白引物序列：F-AAT TCC ATC ATG AAG TGT GA，R-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC。所有數據應用2-△△Ct相對定量分析法，三個復孔求得平均值。

2 結 果

2.1 肝纖維化小鼠模型的建立情況 HE染色鏡下所見：對照組肝小葉結構正常，無變性、壞死；模型組肝細胞索排列紊亂，膠原纖維增生，肝小葉結構破壞，假小葉形成。 模型組Masson染色所見與HE染色中纖維化基本一致，纖維沉積顯色為淡綠色，提示肝纖維化模型成功建立(圖1)。

圖1 兩組小鼠肝臟HE和Masson染色(×400)

2.2 肝臟組織中α-SMA的表達 兩組小鼠的肝組織可見α-SMA大量表達(圖2)，模型組的α-SMA表達(0.48±0.02)明顯高于對照組(0.08±0.01)，差異有統計學意義(t=76.461，P<0.001)。

圖2 兩組小鼠肝組織α-SMA免疫組織化學染色(×400)

2.3 小鼠脾臟的Th22細胞亞群比例 兩組小鼠的Th22細胞亞群比例明顯升高(圖3)，模型組的小鼠脾臟Th22細胞亞群比例(12.83±1.04)高于對照組(1.98±0.05)，差異有統計學意義(t=46.740，P<0.001)。

圖3 兩組小鼠Th22細胞代表性的圖像

2.4 RT-PCR檢測肝組織IL-22和miR-200a mRNA的表達 模型組小鼠肝臟IL-22 mRNA相對表達量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組小鼠肝臟miR-200a mRNA相對表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠肝組織IL-22、miR-200a mRNA 的表達 ()

3 討 論

肝纖維化是繼發于各種慢性致病因素(如病毒性肝炎、酒精性肝病、某些代謝性疾病等)引起的肝臟損傷和炎癥后組織修復過程中的代償反應，是各種慢性肝病向肝硬化發展所共有的病理改變，其主要以細胞外基質的過度產生和沉積為特點。本研究采用CCl4建立肝纖維化模型，HE及Masson染色顯示模型組的肝細胞索排列紊亂，膠原纖維增生，肝小葉結構破壞，假小葉形成；模型組肝組織α-SMA的表達明顯高于對照組(P<0.05)。提示本研究采用CCl4建立肝纖維化模型成功。

Th22細胞屬于CD4+T細胞功能亞群，表達CCR6、CCR4和CCR10，分泌IL-22和TNF-α，不分泌IFN-γ、IL-4、IL-17，是獨立于Th1、Th2和Th17的細胞亞群。Th22細胞參與了自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發生發展過程，例如在銀屑病[1]、狼瘡性腎炎[2]、病毒性心肌炎[3]、幽門螺桿菌相關胃疾病[4]、藥物性肝炎[5]及急性肝衰竭[6]中發揮重要的作用。我們前期對Th22細胞及其效應因子IL-22在肝纖維化發生作用機制的研究發現：乙型肝炎(乙肝)肝纖維化患者外周血Th22細胞占CD4+淋巴細胞比例明顯高于慢性乙肝患者和健康對照人群；乙肝肝纖維化患者CCR4+Th22、CCR6+Th22、CCR10+Th22細胞占Th22細胞比例顯著高于慢性乙肝患者和健康對照人群。Th22主要分泌 IL-22，這是一種特殊的免疫調節因子，屬于白介素10家族細胞因子。 IL-22參與多種疾病的病理生理過程，它通過受體激活下游信號通路發揮生物學作用。IL-22的受體復合物是IL-10R2與IL-22R1構成的異源二聚體，IL-22與其受體結合后，激活JAK/STAT通路，通過STAT3活化發揮作用。我們前期的研究發現，肝纖維化小鼠體內IL-22及其特異性受體 IL-22R1和 IL-10R2明顯升高，提示肝星狀細胞中IL-10R2和IL-22R1呈高表達。肝組織中除了肝細胞，肝星狀細胞也是IL-22的靶細胞。研究表明，IL-22治療可阻止T細胞性肝炎的發展、刺激肝臟再生[7]，延緩脂肪肝的進展[8-9]，誘導肝星狀細胞的衰老，從而改善肝纖維化發生[10]。本研究中模型組小鼠第 8 周可檢測到脾臟 Th22細胞比例升高及肝臟組織的IL-22 mRNA 水平升高，提示Th22細胞和IL-22參與了肝纖維化的發病過程，Th22細胞分化可能與肝纖維化發病過程中肝臟的自身免疫反應有關。

miR-200主要參與蛋白磷酸化、DNA結合、RNA代謝調控、小泡碎片過程。有研究發現，miR-200a在肝纖維化、肝硬化及肝癌中的表達下調，且隨著肝纖維化進展及其程度加深，miR-200a的表達會更低[11-15]。肝癌患者miR-200a表達降低，且miR-200a低表達者的預后較高表達者好，機理是miR-200a經靶基因MACC1發揮了抑制腫瘤生長和轉移的作用[16]。另外有研究發現在大鼠肝纖維化模型中，miR-200a 可以通過Wnt/β-catenin和TGF-β通路降低肝星狀細胞活性，從而減緩肝纖維化的發展[17]。miRNAs在不同疾病中對輔助T細胞有一定的調控作用。對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的研究表明，miR-20b的異位表達可抑制Th17細胞在體外的分化，體內過表達miR-20b可導致Th17細胞數量下降，并減輕自身免疫性腦脊髓炎的嚴重程度[18]。在小鼠肝炎模型中，使用miR-let-7a 預處理后，小鼠肝組織中的Th17細胞顯著下降，而調節性T細胞數量明顯上升[19]。本研究結果顯示，小鼠模型組肝臟組織的miR-200a mRNA的相對表達量明顯低于對照組(P<0.05)，提示miR-200a參與了肝纖維化的發生發展，但是肝纖維化免疫微環境中的miR-200a對Th22細胞的調控機制尚未明確，需要進一步研究。

綜上所述，肝纖維化小鼠的脾臟Th22細胞亞群比例明顯升高，肝纖維化小鼠肝臟組織中IL-22呈高表達，但是肝纖維化小鼠肝臟組織中miR-200a呈低表達，Th22細胞和miR-200a mRNA是否存在交互作用協同參與肝纖維化的進展還有待進一步的研究證實。