HPLC法測定蒙藥波仁阿如-10丸中羥基紅花黃色素A的含量

崔小冬，白鮮籽，都 蘭，全 霞，吳阿古達木

(呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010020)

波仁阿如-10是由訶子、紅花、白豆蔻、五靈脂、紫花地丁、刀豆、枇杷葉、茜草、紫草、刺柏葉十味藥材組成。具有清腎熱的功能，用于腎熱，腎損傷，小便不利，尿頻，腰腿酸痛[1]，原散劑中含有枇杷葉、五靈脂、刺柏葉，服用時刺激咽喉，因此臨床常用其丸劑來增加患者順應(yīng)性。紅花為波仁阿如-10丸中的主藥，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛等功效，羥基紅花黃色素A為其主要活性物質(zhì)。本試驗參考比較2020年版《中國藥典》中紅花相關(guān)含量測定方法[2]以及《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》2007年版[3]、《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》2014年版[4]中羥基紅花黃色素A的含量測定方法，建立了測定羥基紅花黃色素A的髙效液相色譜法。該方法操作簡單，專屬性強。目前波仁阿如-10丸質(zhì)量控制方面無含量測定項。本試驗將采用HPLC法對其中的羥基紅花黃色素A含量進行測定。為該制劑品種的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技(中國)有限公司);

QUINTIX35-1CN電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑

甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 試藥

羥基紅花黃色素A對照品(批號111637-201810；純度93.1%)購于中國食品藥品檢定研究院；波仁阿如-10丸(20210411、20210412、20210413)由呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。陰性樣品(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(以三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.1)(19∶2∶79)為流動相；檢測波長為403nm，柱溫35℃。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計算，應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液制備

對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量，加25%甲醇溶液制成每1mL含30μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約1.0g，精密稱定，精密加入25%甲醇溶液25mL，稱定重量，超聲處理(功率120W，頻率40kHz)40分鐘，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液的制備 取陰性樣品(缺紅花)適量，研細，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

1.池塘條件。該項目所利用池塘地勢平坦、水源充足、水質(zhì)良好、周邊沒有污染源，并具備水、電、路三通的基本條件。池塘面積多數(shù)都在5～10畝，可蓄水1.3～2m，池埂較寬，池堤坡度1∶3。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察

取5.00mg羥基紅花黃色素A對照品轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，加25%甲醇至刻度線搖勻，制成93.10μg/mL的對照品溶液。分別用移液管精密吸取0.5mL，1mL，3mL，5mL，9mL，10mL轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，加溶劑至刻度，分別稀釋成4.66μg/mL，9.31μg/mL，27.93μg/mL，46.55μg/mL，83.79μg/mL，93.10μg/mL的對照品溶液。各吸取20μl注入高效液相色譜儀中。以峰面積對濃度進行回歸分析，結(jié)果顯示羥基紅花黃色素A在4.66～ 93.10μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=52.14x-19.404，(r=0.99998，n=6),結(jié)果見表1。

表1 羥基紅花黃色素A的標準曲線

2.4.2精密度試驗

取2.2項下的羥基紅花黃色素A對照品溶液，按照2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6針，進樣量20μl，其峰面積的平均值為1352.3，RSD為0.10%。說明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗

取同一批號樣品(批號20210411)供試品溶液，在0h，2h，4h，6h，8h，16h的時間點按照2.1項下條件進行測定，結(jié)果見表2。羥基紅花黃色素A的峰面積積分值的RSD值為0.39%，表明供試品溶液在16小時內(nèi)穩(wěn)定。

表2 不同時間測定樣品中羥基紅花黃色素A的峰面積積分值

取同一批號樣品(批號20210411)6份，每份各取約1.0g，按照“2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行含量測定，羥基紅花黃色素A的RSD值為0.57%結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗含量測定結(jié)果

結(jié)果表明：供試品中指標性成分含量RSD值<2.0%，重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗

精密稱定供試品(批號20210411)9份，每份約1g，分別置于9個25mL容量瓶中并分成三組。每組分別用移液器加入羥基紅花黃色素A對照品溶液(93.10μg/mL)6.87mL，8.59mL，10.31mL，(約相當于供試品含量的80%，100%，120%)，再加入25%甲醇至刻度。照2.2項下的方法處理后各20μl注入高效液相色譜儀中。得羥基紅花黃色素A的平均回收率為99.86%，RSD為1.17%，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率測定結(jié)果

結(jié)果表明：供試品中指標性成分回收率在98%以上，RSD值<2.0%，表明方法準確度較好[5]。

3 樣品含量測定

對三批樣品按擬定的含量測定方法進行測定，按外標法計算羥基紅花黃色素A成分的含量，結(jié)果見表5。對照品、樣品、陰性樣品、空白溶劑測定色譜圖見圖1。

圖1 波仁阿如-10丸高效液相相關(guān)圖

表5 樣品測定結(jié)果

根據(jù)以上三批波仁阿如-10丸測定，樣品中羥基紅花黃色素A最低含量在0.77mg/g以上。樣品所用紅花藥材中羥基紅花黃色素A含量為12mg/g(1.2%)，計算羥基紅花黃色素A在該制劑中的轉(zhuǎn)移率為67.54%，由于2020版《中國藥典》一部“紅花”藥材中羥基紅花黃色素A的限度為不得少于1.0%，按該限度折算樣品中羥基紅花黃色素A的理論含量不低于0.64mg/g(按100%出成率計算)，結(jié)合轉(zhuǎn)移率再下調(diào)10%[6]，因此暫定本品每1g含紅花以羥基紅花黃色素A(C27H30O15)計，不得少于0.58mg。

4 討論

4.1 流動相的選擇

通過采用《中國藥典》2020年版一部“紅花”項下、《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》2014年版阿嘎如-10項下及《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》2007年版奧·古日古木-13丸項下羥基紅花黃色素A的含測方法測定對照品及樣品，比較后最終確定流動相條件為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(以三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.1)(19∶2∶79)，該條件下目標峰與其他成分達到較好的分離效果，峰型較好，保留時間合適。

4.2 捉取溶劑的選擇

在4.1項下溶劑均采用25%的甲醇，后增加50%甲醇溶液、甲醇進行同等條件下制備樣品測定比較，25%甲醇提取樣品含量測定結(jié)果高于其余兩種溶劑，因而選用25%的甲醇溶液作為提取溶劑。

5 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定蒙藥波仁阿如-10丸中羥基紅花黃色素A的含量，結(jié)果分離度良好。本含量測定方法簡便快捷，專屬性強，重現(xiàn)性好。可作為波仁阿如-10丸的質(zhì)量控制的標準之一。