基于網絡藥理學探討馬齒莧藥理作用的分子機制

張偉

開封市兒童醫(yī)院，河南 開封 475000

馬齒莧，又名長壽菜，為常見的藥食同源的中藥，來源廣，應用廣泛，內服用于治療痢疾，有降糖、降脂等作用［1］，外用可以治療濕疹、扁平疣和尖銳濕疣等［2－3］。其性寒味酸，入大腸、肝、脾經，有清熱解毒、消癰利尿之功效，適用于濕熱或熱毒所致的痢疾、癰腫和淋癥等［4］。有研究表明，其性寒滑利，清血分及大腸熱毒，為中醫(yī)臨床治痢疾的常用品，有“痢疾克星”之稱［5］。《本草綱目》記載“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產后虛汗”。中藥因其成分復雜，靶點眾多，應用網絡藥理學研究中藥藥理作用的分子作用機制有重要意義。

本研究通過收集整理馬齒莧的主要成分和作用靶點，構建成分靶點網絡，采用網絡藥理學的方法分析馬齒莧藥理作用的分子機制，為尋找馬齒莧潛在的藥理作用提供了依據(jù)。

1 方法

1.1 活性成分及靶標蛋白的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP）［6］（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）檢索“馬齒莧”。口服生物利用度（oral availability，OB），即口服后藥物以原型形式進入血液循環(huán)的相對量，是確定藥物生物活性，可作為藥物的關鍵指標，篩選值≥30%。類似性（drug－likeness，DL）是基于相似性原理，總體相似的分子應具有相似的生物活性；DL≥0.18，即“類藥物”化合物的選擇標準。根據(jù)活性成分在相關靶點中選出相應的靶點蛋白名稱。

1.2 靶蛋白的基因symbol確定及成分－靶基因網絡的構建通過UNIPROT［7］數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）和GENECARDS［8］（https：／／www.genecards.org／）數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白轉化為相應的gene symbol，采用Cytoscope3.6.0軟件構建成分－靶基因網絡圖。

1.3 構建蛋白相互作用（protein－protein interation，PPI）網絡應用STRING［9］（https：／／stringdb.org／）數(shù)據(jù)庫構建相關靶蛋白的PPI網絡，并根據(jù)度值篩選核心網絡作用圖。

1.4 靶蛋白的富集分析采用在線富集分析網站Metascape［10］（https：／／metascape.org／gp／index.html）對靶點蛋白進行GO富集分析和KEGG通路富集。

1.5 實驗流程圖見圖1。

圖1 實驗流程圖

2 結果

2.1 活性化合物的篩選結果從馬齒莧中共篩選出10種（占54種化合物的18.52%）具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）的化合物。見表1。

表1 馬齒莧活性化合物篩選結果

2.2 化合物－靶點相互作用網絡共篩選出靶點221個蛋白基因。化合物－靶蛋白基因相互作用網絡圖，見圖2。

圖2 馬齡莧有效成分－靶點作用網絡圖

2.3 靶基因相互作用網絡（PPI分析）及高連接子圖篩選將所有靶基因數(shù)據(jù)導入STRING數(shù)據(jù)庫中進行PPI分析，PPI網絡圖共212個節(jié)點，3 898條邊，網絡異構度為0.808，聚集系數(shù)為0.585，PPI富集P＜0.001，蛋白相互作用包括共表達、共現(xiàn)、融合、調控和注釋途徑等相互作用［11］。度值前10位節(jié)點的拓撲學參數(shù)，見表2。蛋白質網絡中節(jié)點度值越大，表明該蛋白質參與的相互作用越多，體現(xiàn)了該蛋白質與周圍蛋白質之間的直接聯(lián)系的能力更強，對于蛋白質網絡的影響力就越大，該蛋白質是關鍵蛋白質的可能性越大［12］。度值最高的AKT1是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶之一，調節(jié)多種過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成［13－15］。ALB為血漿白蛋白，在調節(jié)血漿膠體滲透壓中起到重要作用，并充當多種內源性分子及外源性藥物的載體蛋白［16］。白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）參與炎癥反應，在急性期參與B細胞活化［17］。TP53、TNF、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8均參與腫瘤的生成和壞死［18－23］。見圖3。

表2 度值前10位蛋白的拓撲學參數(shù)

圖3 PPI作用網絡及核心網絡篩選圖

2.4 靶蛋白基因GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析和KEGG通絡富集均在Metascape（https：／／metascape.org／gp／index.html）上完成，GO富集分析包括生物過程（biological progress，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular component，CC）。選取顯著性前20位富集結果做氣泡圖，圖4為BP富集結果，圖5為MF富集結果，圖6為CC富集結果，圖7為KEGG通路富集結果。MF富集分析顯示了作用靶點多具有與配體激活的轉錄因子活性、核受體激活、類固醇激素受體激活、銨離子結合、神經遞質受體激活等分子功能，BP富集分析主要包括對有機環(huán)狀化合物反應過程、對有毒物質反應過程、對無機物的反應過程等；CC富集分析顯示這些靶點蛋白主要分布在突觸后膜、細胞質核周區(qū)域、細胞外基質等；主要的通路包括癌癥通路、乙型肝炎通路、動脈粥樣硬化通路等。說明馬齒莧作用范圍廣泛，通過多種途徑調節(jié)機體功能，包括腫瘤形成、乙型肝炎、動脈粥樣硬化等。

圖4 BP富集分析氣泡圖

圖5 MF富集分析氣泡圖

圖6 CC富集分析氣泡圖

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

顏色由綠到紅為－log10（fdr）范圍從小到大，－lg（fdr）越大說明顯著性越強，fdr為調整后P值，即q值），氣泡大小為富集的基因數(shù)目，縱坐標為各個富集的名稱，橫坐標為富集倍數(shù)。

3 討論

本研究通過對馬齒莧的有效成分進行篩選，尋找靶點蛋白，轉換成靶點基因，靶基因相互作用和富集分析來研究馬齒莧藥理作用的分子機制。符合多靶點、多通路和多種分子機制共同作用的條件。有效成分的篩選僅僅從口服生物利用度和參數(shù)方面考慮，沒有考慮有效成分在馬齒莧中的含量濃度，可能會存在一定的誤差。

蛋白質不能獨立執(zhí)行生物功能，而是通過相互作用以協(xié)作的方式完成生物功能，PPI在生命活動中起到核心作用。PPI是互相作用的蛋白質在物理上的接觸，形成蛋白質復合物或短暫接觸后又發(fā)生了分離［24］。通過PPI網絡分析，發(fā)現(xiàn)馬齒莧作用的主要蛋白AKT1參與炎癥、癌癥、糖尿病及心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展。研究表明，AKT信號通路在心肌肥厚和重塑中起著重要作用［25］。馬齒莧前10的作用靶點分子中除了AKT1，IL－6、TNF也是炎癥反應中重要的細胞因子。IL－6是細胞因子網絡中重要成員，在急性炎癥反應中處于中心地位，可誘導產生C反應蛋白和降鈣素原生成，與炎性疾病及感染程度直接相關［26］。研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧可以抑制IL－6表達，抑制潰瘍性結腸炎的癌變［27］。前10作用分子中其他靶點參與腫瘤發(fā)展、細胞分裂等。研究表明，馬齒莧中提取的多糖能提高小鼠的免疫功能，同時也可直接抑制腫瘤細胞分裂［28］。有實驗發(fā)現(xiàn)，馬齒莧通過驅邪扶正作用起到抗病毒作用［29］。富集分析結果顯示了馬齒莧的靶蛋白多參與細胞分裂、轉錄調節(jié)等生物過程。這些研究結果均與基因富集分析結果中靶基因蛋白所參與的多條癌癥通路及心血管疾病通路相對應。有研究表明，馬齒莧提取液具有抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌等作用［30］，本研究重點關注于馬齒莧在人體中潛在存在的靶點蛋白的作用，其他生物的靶點蛋白不在考慮范圍內。

本研究僅分析了馬齒莧的作用分子機制，沒有把相關疾病靶點映射到其作用靶點中，探討馬齒莧與某種疾病的關系。后續(xù)研究要注意把相關疾病與馬齒莧作用靶點相互映射，為中藥治療相關疾病的開發(fā)提供依據(jù)。