七氟醚、異氟醚降低順鉑誘導的骨肉瘤MG63細胞的凋亡及機制探討

鄒海盯，羅偉

（中南大學湘雅二醫院 麻醉科，湖南 長沙 410011）

0 引言

骨肉瘤患者化療及手術是常用治療方法，順鉑即順式-二氯二氨合鉑，屬于細胞周期非特異性藥物，作為一種細胞周期非特異性抑制劑，在骨肉瘤化療中比較常用。而有研究表明，七氟醚可以增強肺腺癌A549細胞對順鉑化療敏感性，其與MMP-2、MMP-9、Ezrin和Fascin蛋白表達變化有關[1]。而七氟醚、異氟醚作為骨腫瘤手術常規麻醉藥物，其對骨腫瘤化療敏感性的影響未見有相關文獻報道。本研究擬在體外條件下研究七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63化療敏感性的影響及初步探索發揮作用可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料。骨肉瘤MG63細胞株由第四軍醫大學唐都醫院骨腫瘤研究所提供；順鉑（DDP）購自山東齊魯制藥廠；異氟醚（Isoflurane，Iso）購自魯南貝特制藥有限公司；七氟醚（Sevflurane，Sev）購自美國Baxter公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；胰酶細胞消化液購自碧云天生物技術有限公司；MTT、Annexin V-FITC凋亡試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、PS（青霉素+鏈霉素）自西安國安生物科技有限公司；七氟醚、異氟醚吸入式動物麻醉機購自上海瑞曼信息科技有限公司；96孔板、培養瓶、6孔板、培養皿購自美國COSTAR公司；麻醉氣體監測儀購自荷蘭Philips公司，流式細胞儀購自美國BD公司；連續波長酶標儀購自瑞士帝肯公司；密閉有機玻璃箱；BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；RIPA裂解液購自西安晶彩生物科技有限公司；免抗Bcl-2、兔抗Bax購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養：將骨肉瘤MG63細胞移至培養瓶中，添加5 mL含10%胎牛血清的培養基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每隔2～3 d傳代一次，1∶2傳代。

1.2.2 實驗分組與藥物處理：對照組，未用藥物處理；七氟醚組，2.5%七氟醚作用4 h；異氟醚組，2.0%異氟醚處理4 h；順鉑組，10 mg/L的順鉑處理24 h；七氟醚+順鉑組，10 mg/L的順鉑處理24 h，其前4 h用2.5%七氟醚處理；異氟醚+順鉑組，10 mg/L的順鉑處理24 h，其前4 h2.0%異氟醚處理。藥物處理方式：將細胞接種于培養皿或96孔板中，24 h后將細胞放置于有機玻璃箱中，七氟醚或異氟醚揮發罐與其進氣口相連，分析七氟醚或異氟醚濃度的氣體分析儀與其出氣口相連，先打開氣體罐（含5% CO2、21 %O2、74 %N2，模擬培養箱中氣體成分），將氣流調至3 L/min預充3 min，使該混合氣體充滿密閉容器中，再將流量減至0.5 L/min，打開七氟醚或異氟醚揮發罐，使吸入麻醉藥濃度達到上述對應濃度，并維持穩定狀態5 min，夾閉進氣口和出氣口，將密閉有機玻璃箱入于37℃恒溫箱中處理4 h，之后取出再置于培養箱中培養，20 h后進行MTT、流式細胞術檢測。

1.2.3 MTT檢測各組細胞活力：取對數期生長的MG63細胞，制成單細胞懸液，計數并調整細胞濃度為1×104個/mL，接種于96孔板中，每孔加入200 ul，并設7個復孔及1個只加入培養基的空白對照孔。培養24 h后，按各組分別處理。每孔加入5 mg/mL MTT，4 h后用DMSO溶解紫色結晶，在490 nm波長下檢測各組的吸光光度值（OD值），并作統計學分析。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡：收集各組細胞，制備成單細胞懸液，固定、染色后用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測Bcl-2、Bax表達情況：收集各組細胞，提取蛋白，用BCA法進行蛋白定量并制樣。再進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，加入一抗Bcl-2（1:500）和Bax（1:500）4℃雜交過夜，之后二抗常溫孵育1h，再用化學發光法檢測目的條帶。

1.3 統計學處理。采用SPSS 25.0軟件進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示。OD值、細胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白表達比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett’s T3法（方差不齊）。P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組骨肉瘤MG63細胞活力的比較。10 mg/L順鉑作用MG63細胞24 h后，細胞毒性較強（細胞殺傷率為50%，P＜0.05），七氟醚、異氟醚均對MG63細胞的毒性作用微弱（分別為3%和4%，P＜0.05），但與單獨使用順鉑組相比，七氟醚或異氟醚聯合使用順鉑，細胞毒性反而降低（分別為13%和15%）。提示順鉑、七氟醚、異氟醚對骨肉瘤MG63細胞具有一定的細胞毒性，但七氟醚、異氟醚能減弱順鉑對MG63細胞的毒性作用，見表1。

表1 各組細胞吸光光度值（OD）的比較（±s）

表1 各組細胞吸光光度值（OD）的比較（±s）

注:與對照組相比,＊P＜0.05; 與DDP組相比,﹟P＜0.05。

Group Ctrol 2.5%Sev 2.0%Iso DDP 2.5%Sev+DDP 2.0%Iso+DDP OD 0.98±0.05 0.89±0.05＊ 0.89±0.06＊ 0.37±0.08 0.50±0.02﹟ 0.50±0.03﹟

2.2 各組MG63細胞對順鉑誘導的凋亡率的比較。七氟醚+順鉑組（37.7%）和異氟醚+順鉑組（40.3%）與單純順鉑組（50.8%）相比，細胞凋亡明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。提示七氟醚和異氟醚能夠減弱順鉑對骨肉瘤MG63的細胞毒性，見表2、圖1、圖2。

表2 各組細胞凋亡率（OR）的比較（±s）

表2 各組細胞凋亡率（OR）的比較（±s）

注:與DDP組相比＊P＜0.05。

Group Ctrol 2.5%Sev 2.0%Iso DDP 2.5%Sev+DDP 2.0%Iso+DDP OR 6.76±0.33 5.66±1.15 5.16±1.14 50.8±2.81＊ 37.7±5.34＊ 40.3±1.96＊

圖1 各組細胞凋亡率的比較

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

2.3 各組骨肉瘤MG63細胞Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較。七氟醚+順鉑組（63%）和異氟醚+順鉑組（63%）與單純順鉑組（123%）相比，Bax蛋白表達水平降低，七氟醚+順鉑組（22%）和異氟醚+順鉑組（36%）與單純順鉑組（40%）相比，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。提示七氟醚和異氟醚降低順鉑對骨肉瘤MG63細胞的細胞毒性可能與Bcl-2、Bax有關。見表3、圖3、圖4、圖5。

圖4 各組Bax蛋白表達水平與順鉑組相比

圖5 各組Bax、Bcl-2蛋白表達

表3 各組MG63細胞Bcl-2、Bax蛋白表達水平的比較（±s）

表3 各組MG63細胞Bcl-2、Bax蛋白表達水平的比較（±s）

Note: ﹟P＜0.01,與DDP組相比，＊P＜0.05,與DDP組相比。

Group Bax Bcl-2 DDP 1.23±0.20 0.22±0.08 2.5%Sev+DDP 0.63±0.12﹟ 0.36±0.08＊2.0%Iso+DDP 0.63±0.13﹟ 0.40±0.12＊

圖3 各組Bcl-2蛋白表達水平與順鉑組相比

3 討論

骨肉瘤是臨床常見的原發性惡性骨腫瘤，常見于青少年。70年代以前關節離斷和截肢為治療骨肉瘤主要手段主，5年生存率維持在20%左右。70年代后，化療聯合手術治療使骨肉瘤患者5年無病生存率超過50%[3-4]。順鉑常用作骨肉瘤患者的化療。其可抑制腫瘤細胞DNA合成及復制，從而抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。近年有國外文獻報導，麻醉藥可影響順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用[5]。國內也有研究發現嗎啡可減弱順鉑對人鼻咽癌CNE-2細胞的殺傷作用，其機制可能與嗎啡改變Bcl-2、Bax表達相關[6]。又有研究發現七氟醚對艾氏腹水腫瘤細胞有一定的細胞毒性作用，而當七氟醚與順鉑聯合應用時，其可減弱順鉑對艾氏腹水腫瘤細胞的細胞毒性作用；而七氟醚可增強順鉑對外周血白細胞、肝細胞、腎細胞的細胞毒性[7]。而梁樺等發現七氟醚可增強順鉑對人肺腺癌A549的殺傷作用。對于麻醉藥促進或減弱順鉑對各種細胞的毒性作用，可能與細胞種類有關。

本研究應用七氟醚、異氟醚聯合順鉑作用于骨肉瘤MG63細胞，觀察七氟醚、異氟醚對順鉑對骨肉瘤mg63細胞毒性的影響，并探討相關機制。預實驗發現當10 mg/L順鉑處理骨肉瘤24 h后可引起50%左右的細胞凋亡，故選用順鉑的濃度為10 mg/L。結合相關文獻及前期實驗結果，本研究最終決定選擇2.5%七氟醚、2.0%異氟醚作為處理骨肉瘤細胞的最終濃度。MTT及流式細胞結果表明，與單純順鉑組相比，七氟醚聯合順鉑及異氟醚聯合順鉑組骨肉瘤MG63活力較高，凋亡率較低，提示七氟醚、異氟醚可以降低骨肉瘤MG63細胞對順鉑的化療敏感性。Bcl-2蛋白家族與細胞凋亡有關其包括Bcl-2、Bax等，其中Bcl-2有抗凋亡作用，Bax有促凋亡作用[8-9]。本研究發現，與單獨應用順鉑組相比，七氟醚聯合順鉑及異氟醚聯合順鉑可上調Bcl-2表達并下調Bax表達。而Bcl-2、Bax表達水平與細胞凋亡密切相關。因此七氟醚、異氟醚降低骨肉瘤MG63細胞對順鉑的化療敏感性可能與其上調Bcl-2表達和下調Bax的表達有關。

綜上所述，七氟醚、異氟醚降低骨肉瘤MG63細胞對順鉑的化療敏感性，其機制可能與上調Bcl-2及下調Bax蛋白表達相關。后續我們將利用各種生物技術手段研究其具體機制，為臨床麻醉藥物的選擇提供一定的依據。