丁酸型產氫細菌WN9利用谷糠發酵的產氫特征

王霜傲，張 震，葉思岑，劉 茹，楊 靜，趙 鑫，2

（1.東北大學 資源與土木工程學院，遼寧 沈陽 110819；2.東北大學 智慧水利與資源環境科技創新中心，遼 寧 沈 陽 110819）

0 引言

氫氣，因其獨特的環境友好性和優秀的能量攜帶能力（1.42×105J/g），被廣大科研和商業機構認為是亟待大力開發和推廣的新型能源[1]。除了傳統的物理和化學方法外，還可以采用微生物發酵的方式來制取氫氣，即生物制氫技術。生物制氫技術具有制氫過程溫和穩定、能耗低、可以利用很多廉價的有機廢棄物、可實現有機廢水和廢棄物的質能轉化等優點。雖然生物制氫技術具有很多優點，但是，在生物制氫技術工程化的道路上仍存在著菌種的氫轉化效率有待提升、底物選擇范圍有待拓寬和轉化效率有待增強等問題。

針對產氫菌氫轉化效率有待提升的問題，研究人員開展了高效產氫菌株的篩選以及工程菌株的構建等研究，并取得一些進展。目前，已分離獲得的高效產氫菌株主要來自Clostridium，Enterobacter和Ethanoligenens等 菌 屬[2]。其 中，關于Clostridium菌屬的研究最多，Clostridium菌屬的產氫菌株的產氫效率也相對更高[3]，[4]。張月超分離了1株具有異化鐵還原能力的產氫菌C.bifermentans EZ-1，以葡萄糖為底物時，最大比產氫率（以單位摩爾質量的葡萄糖計）為1.11 mol/mol[5]。Noparat P從油棕汁液中分離了可以利用多種碳源發酵產氫的C.beijerinckii PS-3，其最大比產氫率（以單位質量的總糖計）為140.9 mL/g[6]。Zhang J N從牛糞堆中分離了可以高效轉化纖維素的產氫細菌C.sartagoforme FZ11，以10 g/L微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉為底物時，最大比產氫率（以單位 質 量 的TS計）分 別 為77.2，64.6 mL/g[7]。

在我國，小米主要種植在黃河以北，年產量巨大，隨之產生的谷糠（分為外殼谷糠和內殼谷糠，其中，外殼谷糠是谷子粗加工時的副產物，內殼谷糠是谷子加工成小米時的副產物）處置問題也亟待進一步解決[8]。如果能夠使用發酵產氫微生物，進一步利用谷糠中的纖維素和剩余淀粉，將其轉化為可被利用的氫氣，將為谷糠處置和資源化提供新的思路。

本研究嘗試從富含有機沉淀物的河道底泥中分離獲得高效產氫菌株，并對產氫效率最高的菌株進行生理生化和系統發育鑒定，確定其系統發育地位；在初步了解產氫菌株比產氫率等特性的基礎上，進一步探討其以谷糠為底物時的產氫特征，從而為后續開展谷糠類底物的發酵產氫研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 產氫菌的富集與分離篩選

PYG培 養 基（g/L）:葡 萄 糖10，蛋 白 胨3，酵 母浸 粉1，Na2HPO4·12H2O 21.5，KH2PO4·2H2O 8.1，MgCl2·6H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.1，L-cysteine 0.3。

培養基定容后加熱至100℃，使用注射器轉移至厭氧管中，高純氮氣吹脫殘留溶解氧，橡膠塞封口，121℃滅菌15 min備用。

產氫菌富集物為牡丹江江濱公園富含有機沉淀物的河道底泥。稱取1 g底泥樣品裝入4 mL滅菌離心管，加入3 mL無菌生理鹽水，渦旋振蕩1 min，再靜止1 min，使用無菌注射器取0.5 mL上清液，轉接入厭氧的PYG培養基中。在恒溫搖床中于35℃培養48 h，富集產物經3代轉接，對生物氣進行色譜檢測，對氫氣產量最高的富集樣本使用Hungate滾管技術進行厭氧細菌分離。挑取單菌落轉至新的PYG液體培養基，繼續培養，并持續檢測氣體含量，將產氣能力好的富集菌利用Hungate滾管技術純化至純培養細菌。

1.2 生理生化與系統生物學鑒定

利用Olympus BX51型光學顯微鏡和Hitachi 7500型透射電子顯微鏡觀察所篩選菌株的形態學特征[9]。革蘭氏染色觀察使用標準方法操作。使用北京索萊寶公司的小量細菌基因組提取試劑盒抽提基因組DNA，16S rRNA基因全長使用通用引物BSF 8/27和BSR 1525/1541擴增，PCR擴增條件參照文獻[9]。PCR擴增產物送華大基因公司進行測序分析。測序結果與GenBank數據庫的細菌信息進行比對分析。使用MEGA 6.0構建系統發育樹。

1.3 細菌產氫能力研究

通過在100 mL的厭氧瓶中進行批次實驗來研究細菌的產氫能力，分裝50 mL工作體積的PYG培養基，其余操作與富集培養時一致。按5%的體積比接種對數期的產氫菌，35℃恒溫氣浴震蕩培養，24 h后使用排水法測定生物氣體積。葡萄糖含量通過上海榮盛公司的葡萄糖測定試劑盒檢測。生物量以細菌烘干恒重的細胞干重計算[10]。實驗中，發酵生物氣組分和揮發酸含量使用氣相色譜Agilent 7890A進行測定，色譜柱為GSGASPRO和DB-FFAP[11]。

1.4 以谷糠為底物時的產氫特征研究

谷糠取自遼寧省朝陽縣。內/外殼谷糠分別自然風干后粉粹，經40目分樣篩過篩后備用。為了確定產氫菌以內、外殼谷糠作為唯一碳源時的產氫能力，將谷糠投加量設定為0～70 g/L；同時，探討初始pH為4.0～9.0時，產氫菌利用谷糠產氫的能力。使用質量分數為10%的HCl或NaOH溶液調節培養基的pH值（使用S220型pH計測定）。批次實驗在100 mL的厭氧瓶中完成，分裝50 mL使用谷糠替代葡萄糖的PYG液體培養基，其余操作與之前相同。按5%的體積比接種對數期的產氫菌，35℃恒溫氣浴震蕩培養，48 h后使用排水法測定生物氣體積。

2 結果與討論

2.1 菌株分離與生長特征

經過初步富集與分離，共獲得9株具有較好產氫能力的菌株，其產氫能力如表1所示。其中，編號為WN9的菌株產氫能力最高，在富集培養基中，比產氫率（以單位摩爾質量的葡萄糖計）可達 到1.69 mol/mol。

表1 初步分離菌株的產氫能力比較Table 1 H2 production capacity of different strains

菌株WN9嚴格厭氧，在PYG液體培養基中培養24～48 h后呈乳白色，渾濁但無凝結沉淀。在固體培養基表面可形成直徑為2～3 mm的乳白色不透明菌落，有明顯邊緣，表面光滑，略粘稠。光學顯微鏡觀察發現，菌株WN9呈短桿狀，可運動，革蘭氏陽性，可產芽孢。圖1為菌株WN9的透射電子顯微鏡照片。從圖1可以看出，菌株WN9周身有 多 根 鞭 毛，菌 體 大 小 為0.5～1.0μm×2.0～2.5μm。

圖1 菌株WN9的透射電鏡顯微照片Fig.1 TEM micrograph of strain WN9

2.2 菌株的系統發育特征

菌株WN9的16S rRNA基因序列大小為1 455 bp。與GenBank數據庫已有的模式菌序列的比對結果顯示，菌株WN9與丁酸梭菌模式菌株C.butyricum JCM 1391T（NR1132441）的 相 似 性 最高，為99.9%。結合生理生化特征，確定菌株WN9為丁酸梭菌屬的新菌株，命名為C.butyricum WN9。

2.3 菌株WN9以葡萄糖為底物時的產氫特征

在進一步探討菌株WN9利用其他底物產氫的能力之前，先在35℃的恒溫條件下，對其以10 g/L葡萄糖為底物的發酵產氫能力進行了研究。經過24 h的培養，菌株WN9對葡萄糖的利用率為91.7%，細胞干重為1.04 g/L，終點pH值為4.10，比產氫率（以單位摩爾質量的葡萄糖計）為1.89 mol/mol，較原始培養提升了11.8%；菌株WN9的氣相末端產物為H2和CO2（體積分數分別約為52.9%和47.1%），液相末端產物為丁酸（約 為2 300 mg/L）、乙 酸（約 為2 200 mg/L）、乙 醇（約為13 mg/L）和丙酸（約為11 mg/L）。實驗結果表明，連續轉代和對數期接種可以進一步提升菌株的生長活性，提升其代謝效率，有助于提高產氫菌的底物轉化利用能力，提高系統的產氫效率。

2.4 菌株WN9以谷糠為底物時的產氫特征

谷糠中含有較多的纖維素和少量的淀粉，可供微生物生長使用。為了探討菌株WN9以其為底物進行發酵產氫的可能性，分別研究了谷糠濃度和初始pH對菌株WN9產氫效率的影響。

2.4.1 谷糠濃度對菌株WN9產氫的影響

為探尋最適的谷糠使用量，在溫度為35℃，初始pH值為7.0的條件下，選擇內、外殼谷糠的投加量（底物濃度）均為0～70 g/L，然后進行發酵產氫實驗，實驗結果如圖2所示。

圖2 底物濃度對比產氫率的影響Fig.2 Effects of substrate concentration on H2 production yield

從圖2可以看出，以內、外殼谷糠為底物時，隨著底物濃度的逐漸增大，比產氫率（以單位質量的TS計，下同）均表現出先增加后降低的變化趨勢，但最大比產氫率并不同時獲得。以外殼谷糠為底物時，比產氫率隨著底物濃度的增加而增長，并在底物濃度為30 g/L時獲得最大值 （12.7 mL/g），隨后，隨著底物濃度的繼續增加，比產氫率則逐步降低。以內殼谷糠為底物時，獲得的比產氫率明顯高于外殼谷糠。當底物濃度為10 g/L時，比產氫率為15.0 mL/g；隨著底物濃度的逐漸增加，比產氫率也逐漸增加，并在底物濃度為50 g/L時獲得最大值（20.1 mL/g）；隨著底物濃度的繼續增加，比產氫率隨之下降。以內殼谷糠為底物時獲得的最高比產氫率是以外殼谷糠為底物時的1.58倍。

底物濃度對產氫系統終點pH值（簡稱為終點pH值）的影響如圖3所示。從圖3可以看出，隨著底物濃度的逐漸增加，以內、外殼谷糠為底物時的終點pH值均表現出下降的趨勢，且以內殼谷糠為底物時的終點pH值的下降趨勢更加明顯。以外殼谷糠為底物時，隨著底物濃度的逐漸增加，終點pH值緩慢降低，從pH 6.55（底物濃度為10 g/L）緩慢降低至pH 5.97（底物濃度為70 g/L）；而相同條件下，以內殼谷糠為底物時，終點pH值快速地從pH 6.43降低至pH 5.14。

圖3 底物濃度對終點pH值的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on endpoint pH

小米谷糠中含有較多硬殼 （纖維素和半纖維素含量很高），這些硬殼很難被細菌直接利用。特別是外殼谷糠，可被利用的有機物更少，而內殼谷糠中除含有纖維素和半纖維素外，還含有少量的淀粉和多糖。因此，以外殼谷糠為底物時，菌株WN9的發酵產氫效率明顯低于以內殼谷糠為底物時。當外殼谷糠濃度增加至30 g/L時，比產氫率獲得最大值。雖然，隨著外殼谷糠濃度繼續增加，有機物濃度增加，但是，可被利用的底物有限，由于底物的限制，總體的比產氫率明顯降低。內殼谷糠的硬殼含量較低，含有更多的可被利用的淀粉和多糖，因此，以內殼谷糠為底物時，菌株WN9的產氫量明顯優于外殼谷糠。當底物濃度高于20 g/L，比產氫率的變化不明顯，僅在底物濃度為50 g/L時獲得最大值，隨后，又略有下降。比產氫率變化不大，說明絕大多數底物中的可利用有機質都被用于細菌的生長和產氫，這與揮發酸產量增加，終點pH值始終保持勻速下降的趨勢相吻合。

2.4.2 初始pH值對谷糠發酵產氫的影響

產氫系統的初始pH值（簡稱為初始pH值）是影響發酵產氫的重要因素之一。為了探尋菌株WN9以谷糠為底物發酵產氫的最佳初始pH值，在溫度為35℃，內、外殼谷糠濃度均為50 g/L的條件下，選擇初始pH值為4.0～9.0進行了對比實驗研究，實驗結果如圖4所示。

圖4 初始pH值對比產氫率的影響Fig.4 Effects of initial pH on H2 production yield

從圖4可以看出，分別以內、外殼谷糠為底物時，隨著初始pH值的逐漸升高，比產氫率均表現出先增高后降低的變化趨勢。以外殼谷糠為底物時，比產氫率隨初始pH值的逐漸升高而緩慢增加，并在初始pH值為6.0時獲得最大值（15.5 mL/g）；當初始pH值繼續升高時，比產氫率迅速降低，并明顯低于初始pH值為4.0時的比產氫率。以內殼谷糠為底物時，比產氫率隨初始pH值的逐漸升高而明顯增長，并在初始pH值為6.0時獲得最大值（21.5 mL/g）；當初始pH值繼續增加至7.0時，比產氫率緩慢降低，之后隨初始pH值的升高而迅速下降。

初始pH值對終點pH值的影響如圖5所示。從圖5可以看出，分別以內、外殼谷糠為底物時，終點pH值均隨著初始pH值的升高而升高。但是，以外殼谷糠為底物時的終點pH值始終略高于以內殼谷糠為底物時，特別是在初始pH值為6.0～7.0時，終點pH值的差別更明顯。這說明以內殼谷糠為底物更適宜產氫菌生長，從而產生更多的揮發酸，降低了體系的終點pH值。

圖5 初始pH值對終點pH值的影響Fig.5 Effects of initial pH on the endpoint pH

有研究表明，過低或過高的初始pH值均會降低微生物的活性，或直接抑制細菌的生長，從而導致產氫效率受到影響[13]。但是，與其他研究明顯不同的是，在本研究中，當初始pH值為4.0～6.0時，菌株WN9可以獲得比初始pH值為7.0～9.0時更高的比產氫率，特別是以外殼谷糠為底物時。因此，可以推斷，較低的初始pH值可以幫助破壞谷糠硬殼部分的纖維素和半纖維素結構，有利于釋放其中的有機質，從而更好地被產氫菌株利用，菌株自身代謝產生的有機酸，進一步加快了這一過程，提高了底物的轉化效率。當體系的初始pH值＞7.0時，對底物沒有酸解作用，其中的有機質很難被釋放并利用，因此，比產氫率明顯較低。由于外殼谷糠中的硬殼部分比內殼谷糠多，因此，這一現象更加明顯。

3 結論

本研究從牡丹江河道底泥中分離了1株丁酸型發酵產氫細菌C.butyricum WN9，該細菌以葡萄糖為底物進行發酵時，液相末端產物為乙酸、丁酸、乙醇和丙酸，氣相末端產物為H2和CO2，比產氫率為1.89 mol/mol。以小米內、外殼谷糠為唯一碳源時，最適宜的底物濃度分別為50，30 g/L，且內殼谷糠更易被產氫菌利用，最大比產氫率為20.1 mL/g。低pH條件（pH＜6）有利于酸解外殼谷糠，釋放其中的有機質，提高產氫效率。以內、外殼谷糠為底物時，最適初始pH值均為6.0，最大比產氫率分別為21.5，15.5 mL/g。