蛋白C抗凝系統功能及分子缺陷的研究進展

程禮敏

（皖南醫學院形態學實驗實訓中心，安徽 蕪湖241002）

0 引言

蛋白C抗凝系統是維持機體內凝血與抗凝血系統相對穩定狀態的重要組成部分，蛋白C抗凝系統系統主要包括：蛋白C、蛋白C抑制物、蛋白S、血栓調節蛋白以及內皮細胞蛋白C受體。內皮細胞蛋白C受體不僅在機體的抗凝過程中起作用[1]，同時參與了機體的炎癥反應和免疫應答[2-3]，在細胞保護等方面也具有重要意義。

1 蛋白C抗凝系統各組分的生理結構

1.1 蛋白C（protein C，PC）

PC由肝臟合成，以無活性的酶原形式分泌到血漿，是一種依賴維生素K的雙鏈糖蛋白，蛋白C分子由一條輕鏈和一條重鏈經單一二硫鍵連接而成。PC滅活FVa和FVIIIa的絲氨酸蛋白酶活性位點位于重鏈，當PC的重鏈氨基端上一個小肽段被切下時，就變成一種活化的蛋白C（APC），具有絲氨酸蛋白酶的活性。具體生物學特性詳見后述。

1.2 蛋白C抑制劑（protein C inhibitor，PCI）

PCI是一種依賴肝素的絲氨酸蛋白酶抑制劑，發現于人的血漿、尿液和多種體液中。結構多樣，PCI分子由387個氨基酸殘基組成，活性中心是Arg354-Ser355。PCI抑制譜廣泛，不僅能抑制APC，還能滅活凝血因子Xa、凝血酶、胰蛋白酶等。Geiger[4]在1996年發現PCI在體內的分布存在種族特異性，在人體中，PCI作為一種血漿蛋白，廣泛表達于多種組織器官，但也在男性生殖器官中高濃度存在，卻只表達于小鼠的生殖系統上，提示PCI在生殖過程中的作用，涉及人類生殖的幾個步驟，包括受精過程，而且在不同物種間的調節作用存在差異。

1.3 蛋白S（protein S，PS）

蛋白S是一種依賴維生素K的血漿糖蛋白，以350nM左右的濃度循環于血漿中。人體循環血漿中，大約60%的PS通過高親和力、高分子量復合物與補體調節蛋白C4b結合，形成C4BP結合蛋白。PS具有多種抗凝特性，雜合子蛋白S缺乏癥與靜脈血栓形成風險增加相關。人和小鼠純合子缺乏癥與胎兒期嚴重血栓形成、血管系統發育缺陷等有關。除了抗凝作用，蛋白S還影響C4BP的補體調節特性，而且與TAM家族的酪氨酸激酶受體相互作用[5]。

1.4 血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）

TM是PC的活化輔助因子，是一種表達于血管內皮細胞上的跨膜糖蛋白。含有577個氨基酸殘基，主要構成1個氨基端的C型凝集素區和6個EGF樣結構域。 當TM與凝血酶結合，形成T-TM復合物后，凝血酶的促凝活性即可轉化為抗凝活性，導致凝血酶對蛋白C的激活的級聯反應被大大的加速；與此同時，TM能加速凝血酶激活纖溶抑制物的活化，而起到抑制纖溶反應的作用。已證實TM存在于所有血管內皮細胞中，腦血管除外[6]。現對于血漿可溶性TM作為血管內皮細胞損傷的標志已經達成共識。TM在多種惡性腫瘤中均呈現出特異性的表達，提示TM還可能參與了腫瘤的發生發展[7]。

1.5 內皮細胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor，EPCR）

EPCR分子屬于跨膜蛋白，是與PC/APC具有高度親和力的內皮細胞表面受體。EPCR在體內的表達存在組織特異性，主要表達于大血管以及大部分小動、靜脈的內皮細胞表面[8]。EPCR可在蛋白S的輔助下滅活因子Va和VIIIa，發揮抗凝作用。同時EPCR結合APC后可通過蛋白酶活化受體1（PAR-1）的介導而觸發抗凋亡作用，還可抑制中性粒細胞的激活以及在組織損傷部位的外滲，導致細胞表面的黏附分子CD11b/CD18的表達受到抑制；繼而炎癥細胞因子合成及釋放減少而發揮抗炎作用。此外，EPCR是造血干細胞（HSC）的表面標志物之一，可被用于HSC的分選和純化。EPCR可通過PAR-1信號通路等途徑，參與HSC及其微環境的調節，介導HSC在骨髓中的保留和造血功能的重建[9]。

2 蛋白C抗凝系統的生物學功能

蛋白C抗凝系統的終產物均為活化蛋白C（APC），其各組分發揮生物學功能都將依賴于APC。臨床上運用APC治療，可能對創傷性腦損傷具有重要的治療潛力，在腦卒中模型中具有神經保護作用，APC可改善腦損傷后功能的轉歸，并能促進缺血后新生血管和神經發生，它還能促進血管生成、存活和神經原細胞從小鼠腦室室管膜下區向周圍區域遷移，但這些大腦修復機制的確切作用仍有待確定[10]。此外，不同的研究揭示了PC/APC在肥胖、肺炎、彌散性血管內凝血、阿爾茨海默病、中風等疾病中的潛在作用。

2.1 抗凝作用

APC的抗凝活性主要通過以下三種途徑：（1）APC在Ca2+存在時，在PS的協助下依賴其絲氨酸蛋白酶活性裂解FVa和FVIIIa的重鏈，降低其與磷脂的結合力，影響FII的形成，從而阻止凝血過程的發展；（2）FXa與血小板的結合需要FVa作為媒介，APC滅活FVa后阻礙了FXa與血小板的結合，對凝血級聯反應進行負反饋調節[11]；（3）APC通過滅活纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）的活性以及阻止TAFI的生成，進而誘導t-PA的釋放，起到促纖溶作用。APC作為一種“按需”抗凝血劑，減少凝血酶的形成，它的抗凝活性還具有種專一性。血漿APC或PC水平的降低與靜脈血栓栓塞的風險增加相關。據大樣本統計，PC系統的功能障礙是東北亞地區靜脈血栓性疾病發生的最主要的遺傳風險因素[12-13]。

2.2 抗炎作用

APC可以直接抑制炎癥介質的釋放而發揮直接抗炎作用，且不依賴于其抗凝活性，還可通過EPCR依賴性方式發揮間接抗炎作用。研究證明[14]，單核細胞上的Mac-1通過與EPCR的結合，可作為蛋白C發揮抗凝和抗炎作用的感受器，促使兩大生理功能相互協調整合，從而能夠更好地發揮保護機體的作用。多項體內外研究表明[15-17]，APC的直接抗炎作用是通過下調炎癥因子、趨化因子以及黏附分子的表達，降低白細胞的趨化性、調節白細胞與內皮細胞間的相互作用而達到的。

2.3 抗凋亡作用

APC可以直接改變細胞的基因表達，而不依賴其抗凝活性。APC可直接作用于人臍靜脈內皮細胞，NFKB信號傳導通路被阻斷，凋亡相關基因的mRNA及其轉錄產物表達受抑，而抗凋亡基因表達增加，從而發揮抗凋亡作用。Domotor團隊[18]的研究表明，APC的抗凋亡特性由絲氨酸蛋白酶功能區與EPCR及PAR-1信號通路共同參與，APC通過EPCR介導降解PAR-1，導致人腦內皮細胞中的Ca2+內流減少而起到抗細胞凋亡的作用。

2.4 APC與膿毒血癥

近年關于PC系統與膿毒血癥的報道中證實[19-20]，在膿毒血癥發生發展過程中，患者常合并凝血系統不同程度的功能紊亂，PC系統發揮了重要的作用。在病程發展的早期，表現為凝血系統的激活及血液呈高凝狀態，APC不僅發揮抗凝作用，還能有效改善微循環，增加供氧量，延緩器官衰竭；重癥時表現為彌散性血管內凝血。同時，APC有對抗缺血/再灌注（I/R）損傷的作用。Schoots等[21]在腸I/R損傷模型中觀察到，APC通過抗凝和抗炎的聯合作用可減輕I/R的損傷，保護腸道屏障功能。Heuer[22]在大鼠膿毒癥動物模型中證實，動物在感染后20h，肝臟組織PC mRNA的表達明顯下降，轉錄水平選擇性地降低，PC表達下降，TM、EPCR下調均可引起循環血液中的APC濃度降低，從而加速膿毒癥的進展。通過大量的活體動物實驗表明[23]，利用活化蛋白C治療可減少細胞因子的生成，抑制白細胞粘附，減輕病理損害的程度。APC對膿毒癥的防治作用，可能是抗凝、抗炎、改善微循環、保護器官等多種效應協同作用的結果。APC具有細胞保護功能，它的治療用途已經在嚴重膿毒癥中得到了評估，并且正在評估它在一些具有重要炎癥成分的疾病中的治療作用。

3 蛋白C系統各組分的分子缺陷

3.1 PC的分子缺陷

PC基因定位于2號染色體（2q13～q14），共有10 802個堿基，含有9個外顯子和8個內含子。基因突變種類300多，突變類型以常染色體顯性遺傳多見，也有隱性遺傳，且目前沒有發現明顯的種族及地區差異。臨床上將遺傳性PC缺陷癥分為兩型：I型中，PC活性和PC水平，二者均降低；II型中存在PC分子缺陷，僅PC活性下降，PC水平正常。在I型中，60%以上為錯義突變，由于這些氨基酸的置換導致PC與其他殘基相互作用被改變，干擾蛋白的折疊，致使蛋白快速地在細胞間降解。導致II型PC缺陷癥的突變均是錯義突變，突變多發生在蛋白的功能區。同時PC血漿水平還受基因多態性的調節[24-25]。

3.2 PS的分子缺陷

PS基因定位于3號染色體（3q11.1～3q11.2），由兩個高度同源性基因組成：PSα和PSβ。自1984年首次報道PS缺陷癥以來，迄今已報道的PS基因突變有200多種，為常染色體顯性遺傳。以I型雜合子型多見，在I型基因缺陷中已知有片段缺失、框架移位等，累及1～15外顯子。II型較為少見，其基因突變位于前肽的第一、二類表皮生長因子區。Hurtado等[26]分析12種與PS缺乏相關的天然PROS1突變在基因和蛋白質表達上的功能相關性，發現PS缺乏的主要原因是突變蛋白質的合成、穩定性或分泌缺陷。目前關于PS缺陷的報道只局限于散在的病例研究，還有關于PS與PC的聯合缺陷的個案報道[27]，但都缺乏大規模的病例對照研究，其與血栓性疾病發病的相關性有待進一步的探索。

3.3 TM及PCI的分子缺陷

多項研究表明[28-30]，TM基因的編碼區和調控區含有突變位點或基因多態性，與腦出血、冠狀動脈硬化以及血栓性疾病有密切關系，可溶性血栓調節蛋白濃度調節了腦梗死的風險和預后。但具體的基因突變對生理功能的影響，由于樣本量的不足或是地域、種族差異，至今仍沒有統一結論的報道。目前關于PCI基因突變的研究主要集中在與生殖系統的關系上，突變導致基因表達的蛋白質發生空間結構上的變化，引起男性精子的產生、發育以及成熟均發生障礙，從而造成男性不育[31]。

3.4 EPCR的分子缺陷

人體EPCR基因位于20號染色體q11.2，包含3個內含子和4個外顯子。基因突變影響EPCR蛋白分子的表達，依賴EPCR的PC活化功能受到損傷，可能與動靜脈血栓形成有關[32]。此外，基因多態性與蛋白表達的改變以及家族性和獲得性血栓性疾病有關，同時影響多種疾病，包括：瘧疾、膿毒癥、腫瘤、不良妊娠結局等的易感性[33-34]。目前報道的EPCR基因變異主要在內含子1位點C2532T，外顯子3（6367位點）23bp嵌入，5’-UTR 1651C/G的多態性，內含子2 6333C/T的多態性[35-36]等。目前關于EPCR的分子缺陷都是個別散在的報道，還有待收集大規模的樣本做進一步的探索，對EPCR基因型的進一步深入研究和對自身抗體的識別將有助于預估病患發生血栓性事件的發生率，繼而實行個體化治療。