河蟹顫抖病病原體的實驗室檢測

宮子慧，孫修云

(泗洪縣水產技術推廣站，江蘇 泗洪 223900)

隨著河蟹養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，各種病害也隨之產生，其中顫抖病是較為常見、危害較嚴重的一種，此病又稱“抖抖病”“環(huán)爪病”。該病1990年在我國出現，1997年后呈大規(guī)模流行，1998－1999年為發(fā)病高峰期，3－11月為主要發(fā)病季節(jié)，嚴重發(fā)病地區(qū)發(fā)病率＞90%，死亡率＞70%，對河蟹養(yǎng)殖業(yè)危害巨大(陳愛平等，2011)。螺原體對水生甲殼動物有廣泛的侵染性，除河蟹外，在小龍蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦及青蝦中也相繼發(fā)現螺原體病原。筆者以泗洪地區(qū)河蟹顫抖病發(fā)病塘的病蟹及同塘套養(yǎng)的青蝦為檢測對象，通過對發(fā)病樣本肝胰腺中的細菌和肌肉中螺原體進行鑒定，以期為今后研究提供參考。

一、材料與方法

1.實驗材料

(1)河蟹。采樣時間為2020年8月13日，氣溫31℃，水溫27℃，采集來自9例發(fā)病塘口的病蟹和兩例同池套養(yǎng)的鮮活青蝦。病蟹的癥狀為反應遲鈍、行動緩慢、吃食減少甚至不吃食，病蟹離水后步足顫抖、環(huán)爪、腹部離開地面、附肢極易脫落，青蝦為鮮活、無癥狀樣本。采集的病蟹和青蝦用采樣箱加冰低溫運送到實驗室。

(2)主要試劑。Chel ex 100 sodium f or m購自SIGMA。2×EasyTaq PCR Super Mix購自北京全式金。核酸染料購自生工生物工程(上海)股份有限公司。DL2000 DNA Mar ker購自TaKaRa。螺原體引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)(英文名API 20E)、氧化酶試紙購自梅里埃診斷產品(上海)有限公司。動物用藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。營養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂購自北京陸橋技術股份有限公司。

2.方法

(1)螺原體DNA的提取及檢測。取0.2克河蟹(青蝦)肌肉組織，用剪刀剪碎，置于1.5毫升離心管內，加入200微升5%Chel ex100螯合樹脂混勻液、20微升10毫克/毫升蛋白酶K溶液，混勻10秒，56℃恒溫金屬浴20分鐘，混勻10秒，99℃恒溫金屬浴8分鐘，12 000轉/分離心4分鐘，上清液即為待測樣品DNA。PCR反應體系為50微升，包括2×EasyTaq PCR Super Mix 25微升、引物F1和F2各2微升、滅菌雙蒸水20微升、DNA模板1微升。引物序列為F1：CGCAGACGGTTTAGCAAGTTTGGG和R1：AGCACCGAACTTAGTCCGACAC。PCR反應程序為：94℃預變性3分鐘、94℃變性3秒、56℃退火15秒、72℃延伸10秒，35個循環(huán)，72℃延伸10分鐘，4℃保溫。對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)對271 bp的特異性靶片段進行檢測。

(2)病原菌的分離、鑒定及藥敏實驗。用滅菌棉簽蘸取河蟹肝胰腺，均勻涂于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18～24小時，觀察菌落形態(tài)，并挑取單個菌落劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18～24小時。挑取純化過的細菌制成0.5麥氏單位的菌懸液，采用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)系統(tǒng)測定各分離菌株生理生化特性；同時做氧化酶反應實驗，36℃孵育18～24小時，根據判讀表判讀各反應結果，參照API微生物鑒定系統(tǒng)細菌檢索手冊，得到鑒定結果。用南京菲恩醫(yī)療科技有限公司的動物用藥敏分析試劑板進行藥敏實驗。

二、結果

1.螺原體PCR檢測結果

螺原體檢測結果見圖1，1～9號為病蟹檢測結果，10～11號為青蝦檢測結果，PCR檢測結果顯示病蟹和青蝦螺原體陽性檢出率為100%。

圖1 螺原體PCR檢測結果

2.病原菌生理生化鑒定

對分離得到的5株細菌進行生理生化檢測，結果判定為河流弧菌、熒光/惡臭假單胞菌、嗜水氣單胞菌-1(細菌編碼：7046104)、嗜水氣單胞菌-2(細菌編碼：7246104)、腦膜膿毒性金黃桿菌，具體生理生化特征見表1。

表1 鑒定試劑條檢測結果

3.病原菌的藥敏實驗結果

5株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表2所示。

表2 細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度 毫克/升

三、討論與分析

本次實驗從河蟹顫抖病樣本和同池套養(yǎng)的鮮活青蝦的肌肉中都分離到了螺原體，從病蟹肝胰腺中共分離到5個細菌分離株，并對8種抗菌藥物進行敏感性測定。結果表明，河流弧菌、嗜水氣單胞菌-1和嗜水氣單胞菌-2對紅霉素耐藥，對其余7種抗菌藥物敏感；熒光/惡臭假單胞菌對甲砜霉素、紅霉素耐藥，對氟苯尼考中敏，對其余5種藥物敏感；腦膜膿毒性金黃桿菌對8種藥物均敏感。雖然從病蟹樣本中分離到了細菌，但有可能是河蟹感染螺原體后抵抗力下降的繼發(fā)感染，造成河蟹顫抖病的病原應為螺原體。

河蟹顫抖病要以防為主，樹立通過調控養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，達到預防疾病發(fā)生的目的。池塘每年都要清淤，特別是上一年發(fā)生過病害的池塘，保證淤泥厚度小于5厘米，并曝曬池底，用生石灰或漂白粉徹底清塘。放苗后潑灑葡萄糖類產品，以提高扣蟹的活力和抗應激能力，注重飼料的蛋白質含量和維生素的添加，以保證營養(yǎng)的全面。

建立良好的河蟹養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，保持水質清新，栽種苦草、輪葉黑藻、伊樂藻、狐尾藻等水草，水草栽種應體現多樣性原則，定期用聚維酮碘等消毒劑消毒水體，高溫季節(jié)要加深池水。進入5月定期用乳酸菌、芽孢桿菌、EM菌等微生物制劑改善水體環(huán)境，但要注意禁止與抗生素、消毒殺菌藥或具有抗菌作用的中草藥同用。要盡早使用微生物制劑，通過有益菌的大量繁殖，形成優(yōu)勢種群，與有害微生物競爭附著位置和養(yǎng)分，抑制病原菌的繁殖，微生物制劑也可以加速環(huán)境中有機質的分解，改善水質環(huán)境，保持水體清新。