熒光碳點的水熱法制備及其在檢測方面的應用

劉 博，楊 焜，魏曉慧，蔡軍杰，李 釩，田 豐

（軍事科學院系統工程研究院衛勤保障技術研究所，天津 300161）

0 引言

碳點（carbon dots，CDs）是碳材料中一種新型的納米功能材料。2004年，Xu等[1]采用凝膠電泳分離純化電弧放電法制備單壁碳納米管，首次發現了一種具有熒光性能的碳納米顆粒。2006年，Sun等[2]利用激光蝕刻技術刻蝕碳靶制得熒光碳納米顆粒，并首次命名為碳點。碳點具有優良的光學性能[3]、穩定的熒光性質[4]、良好的生物相容性[5]等特點[6-7]。

水熱法是將有機或無機碳源和水或有機溶劑混合后轉移至反應釜，通過加熱使反應釜內產生高溫高壓制備碳點的一種方法。該方法的優點是一步即可將碳源碳化生成高熒光量子產率且在表面帶有功能化基團的碳點，相較微波法[8]、電化學氧化法[9]等制備方法，水熱法制備工藝較為簡便，且制備出的碳點粒徑較為均勻[10]。

在檢測領域，碳點主要應用在金屬離子、有機小分子、有機大分子、微生物等方面。目前，在金屬離子、有機小分子、有機大分子檢測領域，碳點被用作傳感器的熒光檢測主要有3種檢測策略，即熒光關閉、熒光開啟和熒光比率[11]。在熒光關閉檢測策略中，溶液的變化會影響熒光信號，導致檢測結果不準確；對于熒光開啟檢測策略，熒光開啟的程度與分析物的濃度有關，熒光強度增加更易得到準確的檢測結果；在熒光比率策略中，參考信號可以消除溶液變化引起的誤差，其精度優于熒光開啟策略。碳點傳感器的有效性通常用檢測限（limit of detection，LOD）、傳感器的線性范圍和淬滅比等參數表示。LOD是指可靠檢測和測量的最低分析物濃度；傳感器的線性范圍表示碳點的熒光強度與分析物濃度范圍的線性關系；淬滅比表示分析物淬滅碳點的能力，當淬滅比達到0時，碳點完全失去了光致發光性能[11-12]。碳點用于細菌的檢測方法與金屬離子、有機小分子、有機大分子的檢測方法不同。在細菌的檢測領域，首先利用碳點的熒光特性標記細菌，然后根據熒光強度與細菌數量的線性關系，最終計算出細菌的數量，達到檢測的目的[13]。本文首先介紹水熱法制備碳點，著重對碳點在檢測方面的應用進行綜述，并對水熱法制備的碳點如何更好地應用于檢測領域進行展望。

1 碳點的水熱法制備

1.1 以有機溶液為溶劑制備碳點

Xu等[14]利用酒石酸和麩皮為雙碳源，以二甲基甲酰胺為溶劑，在高壓反應釜150℃下熱處理8 h，制備出光致發光量子產率高達46%、粒徑主要集中在4～6 nm、平均粒徑為4.85 nm的綠色熒光發射碳點（如圖1所示）。該碳點具有優良的化學穩定性和良好的熒光性能，且生物相容性好、細胞毒性低。以石墨烯量子點為研究對象，Zhang等[15]建立了一種簡單的一鍋法制備碳點。以二甲基甲酰胺作為氮的來源與溶劑，制備的氮摻雜石墨烯量子點在紫外燈照射（365 nm）下呈亮綠色發射。這種石墨烯量子點靈敏度高、重現性好、粒徑均一、長期穩定性好。

圖1 以酒石酸和麩皮為雙碳源制備的綠色熒光發射碳點[14]

為合成簡單廉價的碳點，Khaledian等[16]利用番茄汁為反應物，以無水乙醇為溶劑，在高溫高壓反應釜內220℃條件下反應2 h，所制備的碳點在485 nm有較強的熒光發射，其粒徑小于30 nm，熒光量子產率為38%。通過該方法制備的碳點生物相容性好、綠色無毒，對有機磷毒物如二嗪農有較高靈敏度，因此可在該類物質的檢測中較好應用。Yang等[17]采用同樣的方法將檸檬酸和尿素溶于無水乙醇中，在高溫高壓反應釜內180℃條件下反應7 h，制得粒徑在26 nm左右、熒光量子產率為9.47%的氮摻雜碳點。該碳點在pH 6～10的溶液中熒光強度變化不明顯，在pH 7.4下易被鄰苯二酚淬滅，表明基于該碳點的傳感系統可以快速、靈敏、選擇性地檢測鄰苯二酚。Xu等[18]以N-（2-氨基乙基）-3-氨基丙基三甲氧基硅烷為溶劑，以無水檸檬酸為反應物，在240℃下反應1 min，制得硅摻雜碳點（Si-CDs）。該碳點的粒徑在2 nm左右，熒光量子產率為14%，熒光壽命為2.349 ns。該研究在辣根過氧化物酶依賴熒光響應的基礎上，構建了一種新型的熒光傳感系統，能有效地抑制Si-CDs在370 nm激發下470 nm處的熒光。這種方法不僅具有較好的靈敏度，而且避免了碳點與抗體之間復雜的生物結合步驟，大大地拓寬了該方法在食品安全監測領域的應用。

1.2 以水為溶劑制備碳點

碳點存在紅色發射區域的激發和發射不足、抗離子干擾與抗光漂白能力差、抗強酸強堿能力差、量子產率低等問題，這嚴重限制了其在生物醫學分析和治療中的實際應用[19-26]。Yang等[21]將2，5-二氨基苯磺酸溶于蒸餾水，利用水熱法在200℃高壓反應釜中反應10 h，制得粒徑3～7 nm的硫氮共摻雜紅色發射碳點，在500 nm激發波長下測得碳點的絕對量子產率為2.67%。為進一步增強碳點在紅色熒光區域的發射效應，Tao等[22]以聚丙烯酸和乙二胺為原料，利用反應釜在200℃下水熱交聯8h，制備了一種絕對量子產率高達44.18%、粒徑分布在20～30 nm的新型聚合物碳點。通過交聯和包裹熒光中心來降低運動自由度和提供溶劑化效應，從而提高了量子產率，促使該碳點向紅色熒光發射區移動，這進一步豐富了交聯增強發射效應的解釋。

為解決碳點不耐金屬離子干擾的問題，Zhang等[23]首次利用三磷酸腺苷，通過水熱法在180℃的反應釜內反應10 h，制得平均粒徑為3.8 nm的水溶性磷氮共摻雜碳點。制備的磷氮共摻雜碳點在365 nm紫外燈照射下發出明亮的藍色熒光，熒光量子產率為9.8%，其可以抗金屬離子、鹽溶液和高離子強度環境的干擾，具有較高的生物相容性和良好的成像性能，可以應用于多功能復合材料體系中。

為提高碳點的抗光漂白、抗強酸強堿的能力，Liu等[24]以蛋氨酸和檸檬酸為原料，在200℃條件下的高溫高壓反應釜中水熱反應3 h，制備了氮硫摻雜的平均粒徑為5nm的藍色熒光發射碳點（如圖2所示），量子產率為13.8%，平均熒光壽命為3.67 ns。制備的碳點具有良好的熒光性能和抗光漂白性能，由于其表面上的羥基、羧基、氨基而具有很好的水溶性，抗強酸強堿能力強、離子強度高、穩定性好。

圖2 以蛋氨酸和檸檬酸為原料制備的藍色熒光發射碳點[24]

如何制備出高量子產率的碳點一直是研究者要解決的問題。楊焜[25]以無水檸檬酸為碳源，將乙二胺作為表面鈍化劑，在200℃條件下通過一步水熱法制備藍色發射的碳點。該碳點熒光量子產率高達79.7%，熒光性能優異，生物相容性良好，可負載光敏劑用于腫瘤的光動力治療。Hou等[26]對目前常用的檸檬酸-聚乙烯亞胺前體混合物的碳化工藝進行了簡單而有效的改進，在高壓反應釜330℃條件下水熱處理6 h，制備了綠色發射的碳點，其具有很強熒光性能，接近定量熒光量子產率的上限。

2 碳點在檢測方面的應用

2.1 金屬離子的檢測

利用部分金屬離子對碳點熒光有淬滅作用的這一特性，Xu等[14]利用酒石酸和麩皮為雙碳源經一鍋水熱法處理，制備出光致發光量子產率高達46%的綠色熒光發射碳點。利用Cu2+可淬滅該碳點熒光的作用，制備的綠色發射碳點可用于Cu2+檢測。該碳點對Cu2+有很好的選擇性和敏感性，證實了綠色熒光發射碳點對Cu2+的檢測具有很高的準確性。Cu2+檢測范圍為0～0.5 mmol/L，LOD為0.050 7μmol/L。Fe3+是自然界重要的元素，也是人體必不可少的微量元素。Fe3+對碳點同樣具有淬滅作用，Rao等[27]以無水檸檬酸和乙二胺為前體，利用水熱法快速連續地大規模制備量子產率高達60.1%的碳點。該碳點可用于Fe3+的檢測，其LOD為0.239μmol/L。為實現血清中Fe3+與L-半胱氨酸的共同檢測，Yang等[21]以2，5-二氨基苯磺酸前體制備了硫氮共摻雜紅色發射碳點，利用L-半胱氨酸與Fe3+的競爭性關系，該碳點可以快速識別和定量分析Fe3+和L-半胱氨酸，其中Fe3+的檢測范圍為0～30μmol/L（LOD為0.27μmol/L），L-半胱氨酸的檢測范圍為0～24μmol/L（LOD為0.14μmol/L）。利用該碳點對人血清樣品中的Fe3+和L-半胱氨酸進行了檢測，得到的結果令人滿意。此外碳點還運用在Cr6+[28]、Sn2+[29]（如圖3所示）等金屬離子的檢測。

圖3 在開—關—開模式下測定Sn2+和L-賴氨酸的手性碳點探針的制備示意圖[29]

2.2 有機小分子的檢測

谷胱甘肽在代謝等方面發揮著重要作用[30-31]。Pan等[32]提出了一種基于控制碳點表面鈍化程度的新型谷胱甘肽熒光傳感器，制備的碳點對谷胱甘肽的檢測范圍為1.0～50.0μmol/L，LOD為0.943μmol/L。基于碳點的熒光傳感器可作為分析檢測生物環境、保健食品、藥品和化妝品中谷胱甘肽的有效工具。為提高對谷胱甘肽檢測的靈敏度與抗干擾能力，Song等[33]經一步水熱法制備了具有pH依賴性和可變色熒光特性的多功能氮硫共摻雜碳點，可以從半胱氨酸、同型半胱氨酸等其他硫醇中檢出谷胱甘肽，可作為高選擇性檢測谷胱甘肽的探針。該碳點在0～50μmol/L和50～100μmol/L范圍內存在2個良好的線性關系，LOD為6.7μmol/L。炭疽桿菌有很高的致死率，因此對其進行高效精準的檢測至關重要。基于此，Li等[34]開發了一種新型的、靈敏的無標簽傳感器，用于檢測生物威脅劑炭疽的生物標志物二苯胺酸，使用一個熒光“關—開”碳點-銅（Ⅱ）系統。以多巴胺為前體，利用水熱法制備了量子產率為24.7%的熒光碳點，銅（Ⅱ）使碳點熒光淬滅，而二苯胺酸與銅（Ⅱ）結合使得碳點熒光恢復。該碳點對二苯胺酸的檢測范圍為0.25～20μmol/L，LOD為0.079μmol/L。Mao等[35]制備了一種新型的、環保型分子印跡聚合物，并將其作為分子識別元件，構建了多巴胺熒光傳感器。在有機硅烷中，通過水熱法制備了強熒光發射的碳點，對多巴胺的檢測范圍為25～500 nmol/L，LOD為1.7 nmol/L。α-鵝膏毒素可使患者在短時間內死于急性肝衰竭，基于此，Feng等[36]提出了一種利用水熱法制備的碳點嵌入特異性分子印跡聚合物用以直接檢測血清α-鵝膏毒素的新方法，碳點的熒光強度與α-鵝膏毒素濃度在0.05～4.0μg/mL范圍內存在線性關系，LOD為15 ng/mL。

2.3 有機大分子的檢測

碳點作為免疫傳感器已成為檢測抗原和疾病標志物并用于癌癥診斷的重要手段[37]。He等[38]利用精氨酸和檸檬酸為前體通過水熱法制備碳點，碳點作為標記物成功地應用于前列腺特異性抗原的檢測，LOD為0.22 ng/mL。該碳點還可用于檢測癌胚抗原，LOD為0.56 ng/mL。此方法為構建一個靈敏、通用的檢測平臺提供了一種有效的途徑。Zhang等[15]將二甲基甲酰胺作為溶劑和氮的來源，制備出氮摻雜石墨烯量子點。利用紙基電化學發光免疫分析法，以石墨烯量子點作為紙基電化學發光標記、α-胎蛋白抗原作為模型蛋白，通過種子介導生長法制備了一種新型紙工作電極，可成為一種很有前景的抗體附著平臺（如圖4所示）。其對α-胎蛋白抗原線性檢測范圍為0.005～100 ng/mL，LOD為1.2 pg/mL。為實現對非傳染性疾病標志物的測定，Othman等[39]提出了一種基于氮摻雜碳點的高選擇性、快速、環保的核基質蛋白22（NMP22）熒光免疫分析技術。采用水熱法，以檸檬酸和尿素為原料，合成了高量子產率的氮摻雜碳點。單克隆抗體通過酰胺化技術標記氮摻雜碳點，在最佳條件下熒光強度與NMP22濃度在1.3～16.3 ng/mL范圍內呈線性關系，LOD為0.047 ng/mL。該方法可用于人體尿液中NMP22的測定，回收率為96.50%～103.61%。這些結果為非傳染性疾病作為免疫分析熒光標記的潛在用途提供了可能。

圖4 基于種子介導生長法和紙基電化學發光免疫分析法的免疫傳感器制備工藝[15]

2.4 微生物的檢測

快速鑒別大腸桿菌[40-42]和金黃色葡萄球菌對保障人體健康至關重要。Zhao等[43]利用水熱法制備了一種基于pH敏感的碳點，用于糖代謝觸發的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌鑒定。制備的碳點熒光強度在pH 4.0～7.0的酸性范圍內與溶液的酸堿度呈線性關系，利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在糖代謝能力方面存在的差異，該碳點可以產生可區分的熒光信號，用于進一步區分大腸桿菌和金黃色葡萄球菌（如圖5所示）。在葡萄糖存在下，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的LOD分別為21和33 cfu/mL，在乳糖存在下，大腸桿菌的LOD為762 cfu/mL。張春林等[44]以富含氨基的葡萄糖制備出氨基化碳點，通過1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺（EDC/NHS）化學偶聯法構建碳點與大腸桿菌抗體的熒光探針，可以實現對大腸桿菌O157∶H7的快速檢測。為實現人體尿液中的鮑曼不動桿菌的精準檢測，Bahari等[45]開發出一種基于熒光共振能量轉移的新穎的比率型熒光適體傳感器，以鄰苯二胺碳點（o-CDs）、氮摻雜碳點為能量供體，氧化石墨烯為能量受體，用于鮑曼不動桿菌的靈敏性和選擇性檢測。負載在氧化石墨烯邊緣的氮摻雜碳點表現出熒光淬滅，并且隨著修飾的o-CDs與核酸適配體（ssDNA）在氧化石墨烯表面吸附，o-CDs的熒光被有效淬滅。當ssDNA與鮑曼不動桿菌特異結合時，釋放氧化石墨烯中的o-CDs-ssDNA，恢復o-CDs的熒光信號，而氮摻雜碳點的熒光強度變化不大，其熒光強度在比值熒光分析中作為參考信號。熒光強度比（I550 nm/I440 nm）為2.0～10.0，細菌濃度為2.0×103～4.5×107cfu/mL，最低LOD為3.0×102cfu/mL。該方法證明了所研制的適體傳感器用于人體尿液中鮑曼不動桿菌選擇性檢測的可行性。

圖5 碳點辨別并檢測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌原理圖[43]

3 總結與展望

綜上所述，通過水熱法制備的碳點具備優異的熒光性能，已在金屬離子、有機小分子、有機大分子、微生物等領域被廣泛應用。但目前制備出的碳點大多數為藍色發射碳點且量子產率有待提高，因此期望通過改變分子前體或者摻雜氮、硫等元素，獲得多色發射碳點或者獲得熒光性能更強、熒光量子產率更高的碳點。而且碳點的抗酸堿能力弱，在強酸強堿的環境下碳點的熒光強度大大降低，后期希望開發出耐酸堿的碳點，使碳點可應用于強酸強堿的環境。碳點在熒光檢測方面的應用還處于起步階段，對物質識別響應的靈敏度和抗干擾能力需進一步改善，檢測范圍有限而且使用范圍也需要拓展，而不是局限于少數幾種模型分子，后續可以嘗試構建膜載體[46-47]、膠體體系[48]、核殼包覆[49]、加入摻雜物[50]增加碳點的熒光性能，或者利用微流控技術[51-52]實現多通道的快速檢測能力，使碳點可作為優異的標記物用于金屬離子、有機小分子、有機大分子、微生物等快速精準的檢測。在有機大分子方面還存在檢測時間過長、無法實現快速檢測等問題，期望在后續的研究中通過加入一些試劑加速反應，壓縮檢測時間實現快速檢測。在細菌檢測方面期望開發出既能實現細菌精準檢測又具有殺菌抑菌功能的碳點，以實現更好的應用價值。