山茱萸萜類甲羥戊酸合成途徑關鍵酶CoHMGS基因的克隆與分析

侯典云，王瑤瑤#，劉曉冉，張佳琪，馬占強，胥華偉，王笑塵

1.河南科技大學農學院，河南 洛陽 471023

2.洛陽市道地藥材繁育與創新利用工程技術研究中心，河南 洛陽 471023

3.南陽市山茱萸研究所，河南 南陽 474550

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥果肉，是我國傳統名貴藥材，具有補益肝腎、收澀固脫等功效[1]。山茱萸的主要成分有環烯醚萜類、鞣質類、黃酮類、三萜類、苯丙素類等，還包含多種對人體有益的其他物質[2]。現代藥理學研究認為山茱萸具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗炎癥[5]、護肝[6]、降血糖[7]等生物學活性，具有較好的開發應用前景。

植物體內的萜類有2條合成途徑：1條是甲羥戊酸途徑，在細胞質中發揮作用；另1條是發現較晚的甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑，定位在質體[8]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）是甲羥戊酸途徑的關鍵酶，作用于該途徑的第2步反應，催化一分子乙酰乙酰輔酶A和一分子乙酰輔酶A縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A[9]，接著進行后續反應生成相應的萜類物質。HMGS對萜類物質的生物合成至關重要，備受關注，近年來在銀杏[10]、牛樟芝[11]、桑黃[12]、陸英[13]、靈芝[14]和丹參[15]等藥用植物上均有研究，但在山茱萸中未見報道。

在山茱萸轉錄組中，通過分析目前只發現了c102453_g2[16]這1個HMGS基因，利用primer premier 5.0軟件設計引物，采用RT-PCR技術擴增CoHMGS基因，通過生物信息學分析軟件初步探討CoHMGS編碼蛋白質的特征信息，為進一步研究山茱萸體內甲羥戊酸生物合成途徑奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

植物材料經河南科技大學農學院侯典云教授鑒定為山茱萸C.officinalisSieb.et Zucc.植株。采集山茱萸樹上完整無病蟲害且生長狀態基本一致的葉片和果實若干，摘下后立即用蒸餾水沖洗干凈，放進事先準備的1.5 mL離心管內，置于液氮速凍，最后轉移到-80 ℃冰箱保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒（北京天根有限公司，編號：DP441）；cDNA反轉錄試劑盒、2×Long Taq Master Mix、零背景pTOPO-TA克隆載體購自艾德萊生物科技公司；DNA純化回收試劑盒（南京諾維贊有限公司）；感受態的大腸桿菌DH10B（自制）。

2 方法

2.1 引物合成

根據c102453_g2序列設計山茱萸HMGS基因的擴增引物，引物具體序列為CoHMGS-F：5’-GGAGCTAGTGACAGAAAGA-3’和CoHMGS- R：5’-CTGGCAGAATGAGGAACA-3’。

2.2 山茱萸RNA的提取和cDNA的合成

山茱萸葉片用液氮研磨，根據RNA提取試劑盒說明書操作，獲得山茱萸總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop檢測RNA的提取質量和濃度。

2.3 CoHMGS基因克隆與測序

以山茱萸總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，設置25 μL PCR擴增體系：1 μL CoHMGS-F引物、1 μL CoHMGS-R引物、1.5 μL cDNA、12.5 μL 2×Long Taq Master Mix、9 μL ddH2O；CoHMGS基因PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，32個循環；72 ℃終延伸10 min。電泳觀察擴增結果，切膠純化回收目的片段，連接到pTOPO-T載體上形成重組質粒，再通過熱激法將重組質粒轉化進大腸桿菌DH10B中，加入無菌液體LB（Luria-Bertani）培養基振蕩培養60 min左右，濃縮菌液涂布于氨芐抗性的LB平板，選取單菌落搖菌6 h以上，菌液PCR挑選條帶正確的菌液送公司測序。

2.4 生物信息學分析

在NCBI數據庫對CoHMGS基因進行Blast和保守結構域分析，通過Cell-Ploc 2.0在線預測CoHMGS基因編碼蛋白質在細胞內的具體位置，利用ExPASY analysis分析CoHMGS基因編碼氨基酸的特征，使用TMHMM Server推測蛋白質的跨膜結構信息，用MEGA 5.0軟件對山茱萸HMGS編碼的蛋白質進行聚類分析，構建系統發育樹。

3 結果與分析

3.1 CoHMGS基因克隆與測序

圖1 CoHMGS的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of CoHMGS

CoHMGS基因的PCR反應產物電泳檢測結果表明：PCR擴增獲得一條單一亮帶（圖1）。回收純化，然后連接到克隆載體pTOPO-T上，轉化感受態細胞DH10B，經菌落PCR鑒定，挑選陽性菌液送公司測序，獲得長度為1645 bp的序列，經比對確認為CoHMGS的cDNA序列。

3.2 CoHMGS保守結構域分析

對測序得到的DNA序列在NCBI數據庫進行Blast分析，結果顯示山茱萸CoHMGS基因序列和喜樹、人參、三七和杜仲等植物的HMGS基因序列相似程度均在90%以上。結果表明，山茱萸CoHMGS蛋白屬于PLNO2577超家族，是羥甲基戊二酰輔酶A合酶（圖2）。

3.3 CoHMGS亞細胞定位預測

利用相應工具確定CoHMGS的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列。通過Cell-Ploc 2.0在線軟件進行亞細胞定位預測結果顯示：CoHMGS基因編碼蛋白質定位于細胞質內（圖3）。

圖2 CoHMGS蛋白的保守結構域Fig.2 Conserved domains of CoHMGS protein

圖3 CoHMGS蛋白亞細胞定位預測Fig.3 Prediction of CoHMGS protein subcellular location

3.4 山茱萸CoHMGS編碼蛋白的特性分析

ExPASy在線分析結果表明CoHMGS編碼蛋白的相對分子質量為51 875.8，分子式為C2304H3555N605O705S27，理論等電點6.13；絲氨酸數量最多，占比9.8%，負電荷氨基酸共52個，正電荷氨基酸共46個，蛋白整體帶負電荷；預測是不穩定親水性蛋白。TMHMM Server在線分析結果顯示：山茱萸CoHMGS蛋白沒有跨膜結構，是一個膜外蛋白（圖4）。

3.5 山茱萸CoHMGS蛋白的結構預測

通過SOPMA在線預測山茱萸CoHMGS蛋白的二級結構（圖5），包括α-螺旋占43.62%，無規則卷曲占40.64%，自由延伸占12.55%，β-轉角占3.19%。由SWISS-MODEL預測得到該蛋白的三級結構模型（圖6）。

3.6 山茱萸CoHMGS氨基酸序列同源分析

圖4 CoHMGS蛋白跨膜結構域預測Fig.4 CoHMGS protein transmembrane domain prediction

圖5 CoHMGS蛋白二級結構Fig.5 Secondary structure of CoHMGS protein

圖6 CoHMGS蛋白三級結構Fig.6 Tertiary structure of CoHMGS protein

多序列比對分析結果表明山茱萸CoHMGS序列與山梨獼猴桃Actinidia rufaPlanch.的HMGS序列一致性為90.45%、中華獼猴桃Actinidia chinensisPlanch.為90.02%、三七Panax notoginseng(Burkill) F.H.Chen ex C.H.為90.43%、茶Camellia sinensis(L.) O.Ktze.為90.23%、喜樹Camptotheca acuminateDecne.為88.75%、人參Panax ginsengC.A.Meye.為90.21%、榴蓮Durio zibethinusMurr.為90.32%、可可樹Theobroma cacaoL.為89.46%、阿育魏實Trachyspermum ammi(L.) Sprague.為88.82%、杜仲Eucommia ulmoidesOliver.為90.39%。使用MEGA 5.0軟件構建山茱萸CoHMGS與其近緣物種的系統進化樹（圖7），說明山茱萸HMGS與喜樹、杜仲、山梨獼猴桃和中華獼猴桃的同源性較近，三七、人參等植物的HMGS與山茱萸同源性較遠。

4 討論

圖7 CoHMGS蛋白的NJ系統進化樹Fig.7 NJ phylogenetic tree of CoHMGS protein

近年來，隨著研究的深入，許多萜類物質及其 衍生物的活性被解析，成為治療諸多疾病的關鍵成分之一，如能夠有效治療腫瘤的紫杉醇，被譽為天然抗癌藥物，是一種二萜生物堿類化合物[17]；可以抑制瘧疾的青蒿素，是目前為止發現的治療瘧疾耐藥性最好的藥物，屬于倍半萜內酯化合物[18]；明顯減輕心絞痛，長期服用無明顯不良反應，有效緩解冠心病癥狀的丹參酮[19]等。這些天然的中藥活性物質成分安全，對人體危害性小，是不可多得的健康藥物，但是植物的次生代謝產物往往具有種類豐富、產量偏低的特點。因此，通過解析萜類物質的生物合成途徑，從分子水平定向改造植物來提高特定次生代謝產物含量是十分必要的。

甲羥戊酸途徑（MVA pathway）是植物生成萜類物質的重要途徑，主要生成倍半萜和三萜類物質[20]。HMGS廣泛存在于高等植物體內，是MVA途徑中的第2種酶，在有些植物體內HMGS有多個家族成員，Alex等[21]于2000年發現了存在于芥菜中的4個HMGS基因，隨后有研究者發現在巴西橡膠樹內存在2個HMGS基因[22]。研究表明，HMGS基因在植物的不同部位以及發育的不同時期的表達具有明顯的差異性，并且作為MVA途徑中的關鍵酶，影響多種植物發育模式的改變和次生代謝產物的生成[23]。將HMGS在雷公藤懸浮細胞中的差異表達，結果表明：過表達TmHMGS可提高MVA途徑和MEP途徑下游基因的表達量和二萜類化合物雷公藤甲素的含量，RNA干擾會降低MVA途徑和MEP途徑下游的基因表達量[24]。外源激素處理銀杏葉片，發現在合適的激素濃度和處理時間下水楊酸、茉莉酸甲酯、乙烯都能不同程度地提高GbHMGS的表達量，同時也提高了銀杏葉片中萜烯三內酯的總含量[10]。通過在番茄幼苗中過表達芥菜HMGS基因（BjHMGS1），可以明顯地提高萜類物質合成途徑MVA途徑中HMGS上下游基因的表達量，并且也會影響MEP途徑中相關基因的表達，從而提高轉基因番茄果實中萜類物質（類胡蘿卜素、角鯊烯）、α-生育酚以及一些植物甾醇的含量[25]。上述研究均表明HMGS基因在植物體內合成萜類物質的重要性。

山茱萸作為重要的中藥材，其經濟價值、生長習性和活性因子等方面得到了很大程度的開發，以山茱萸作為主要成分的中成藥和保健品種類豐富，然而從分子水平上探究山茱萸活性成分生物合成途經的研究較少。本研究在高通量轉錄組測序的基礎上，首次克隆出山茱萸HMGS基因的全長cDNA序列，并對山茱萸HMGS蛋白的基本特征和功能分析預測，為進一步揭示山茱萸萜類物質生物合成途徑的分子機制奠定了基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突