馬藍BcASB基因的克隆、生物信息學及表達分析

馬小毛，寧書菊，葉 齊，胡永樂,3，蔡國倩，魏道智*

1.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002

2.福建農林大學作物科學學院，福建 福州 350002

3.武夷學院生態與資源工程學院，福建 武夷山 354300

馬藍Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek，爵床科馬藍屬的雙子葉多年生草本植物[1]，是我國南方常見藥用植物。其莖葉炮制而成的青黛，以福建產品質最佳，因此被稱為建青黛，是福建道地藥材之一[2]。馬藍化學成分研究報道，馬藍中含有生物堿、萜類、黃酮類、皂苷等多種植物次生代謝產物[3]，其中吲哚類生物堿被認為是馬藍中主要的藥效成分，分子藥理實驗表明，靛藍、靛玉紅在人體的神經系統、免疫系統等方面發揮著顯著的藥理作用。近年來，禽流感、甲型流感、新型病毒等流行病肆虐頻發，推高了市場上以馬藍為基源的中藥材的價格和需求，因此加強對藥用植物馬藍的研究具有重要的理論和實踐意義[4]。

目前，應用分子生物學技術研究相應的生物合成途徑，克隆和分析關鍵酶基因是植物生物工程研究中提高特定代謝產物累積的重要手段之一[5]。本研究中，主要藥效成分靛藍、靛玉紅的積累基于馬藍吲哚類生物堿合成途徑，一般認為，吲哚生物合成途徑包括2方面：一是莽草酸途徑，二是色氨酸途徑[6]。莽草酸和色氨酸在分支酸合成酶（chorismate synthase，CS）、鄰氨基苯甲酸合成酶（anthranilate synthase，AS）、色氨酸合成酶（tryptophan synthase，TS）、細胞色素CYP450單氧氧化酶（cytphrome P450 monooxygenase，CYP450）、尿苷二磷酸葡萄糖轉移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）等一系列關鍵酶的作用下，最終加氧聚合合成靛藍、靛玉紅等吲哚類生物堿或衍生為其他吲哚類物質，因此，鄰氨基苯甲酸合成酶也被認為是調節色氨酸以及次生代謝產物積累的關鍵酶之一。

鄰氨基苯甲酸合成酶大多存在于植物細胞質體內，是由α亞基和β亞基組成的復合酶[7]，α亞基是關鍵的催化亞基，而β亞基為α亞基的催化反應提供氨基[8]。早在1992年，Niyogi等[9]首次從模式植物擬南芥中克隆出編碼ASα亞基的基因。隨后，于1995年，Bohlmann等[10]從蕓香中克隆出編碼ASα亞基的基因。此后陸續有科學家從水稻[11]、煙草[12]、長春花[13]、喜樹[14]等植物中分離克隆出編碼ASα亞基的基因。與ASα亞基相比，有關ASβ亞基的研究相對較少，但近年來，也有研究者從水稻中分離獲得了編碼ASβ亞基的基因[15]，且表明了2個β亞基之間在酰胺基轉移酶活性方面的功能差異。前期，課題組已從馬藍中分離克隆了鄰氨基苯甲酸合成酶ASα亞基編碼的BcASA基因（GenBank登錄號MH976794），本實驗則對ASβ亞基編碼的BcASB基因進行研究。目前，在馬藍生物堿合成途徑的研究中，尚未見鄰氨基苯甲酸合成酶ASβ亞基的相關報道，因此，要闡釋馬藍藥效物質合成途徑，沒有BcASB基因的克隆和生物學信息的挖掘和分析是不完整的。

因此，本實驗在前期馬藍轉錄組數據研究的基礎上，通過RT-PCR和RACE技術從馬藍鄰氨基苯甲酸合成酶中分離克隆了ASβ亞基編碼的基因，獲得完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），命名為BcASB。通過生物信息學分析，預測該基因編碼蛋白的結構和功能，最后運用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）對BcASB基因在馬藍不同部位的表達進行分析以及檢測馬藍葉在不同外源誘導子處理下的表達情況和馬藍有效成分靛藍、靛玉紅積累量的變化情況，為今后研究該基因的功能以及馬藍吲哚類生物堿合成途徑的研究奠定科學基礎。

1 材料與試劑

樣品采自福建農林大學藥植園，經福建農林大學生命科學學院魏道智教授鑒定為馬藍Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek，于-80 ℃保存，用于后期RNA的提取。

克隆載體pENTR/D-TOPO為本實驗保存，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；DNA Marker、限制性內切酶、T4DNA連接酶、2×TransTaq PCR Mix均購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌感受態細胞DH5α、實時熒光定量PCR試劑均購自TaKaRa公司；茉莉酸甲酯（methyl-jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、乙烯利（ethylene，ETH）均購自寶生物工程（大連）有限公司；色譜甲醇、色譜乙腈、色譜甲酸均購自默克股份兩合公司；靛藍、靛玉紅對照品購自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑均為國內分析純。引物合成和樣品測序由福州鉑尚生物有限公司完成，引物序列見表1。

表1 基因克隆和熒光定量PCR引物Table 1 Sequences of primers designed for gene clone and real-time PCR

2 方法

2.1 馬藍總RNA的提取和cDNA的合成

使用RNA提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit）提取馬藍總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測RNA的完整性、濃度和純度。當28 S是18 S的1.5～2倍時，說明提取的RNA完整性較好，A260/A280為1.9～2.0，RNA濃度≥400 ng/mL時，說明純度和濃度較高，可用于后續實驗。根據反轉錄試劑盒說明書（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser），以提取到的馬藍總RNA為模板合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存備用。

2.2 BcASB基因的克隆及鑒定

根據實驗組前期建立的馬藍轉錄組數據庫信息，使用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計BcASB基因ORF序列的特異性引物（BcASB-F，BcASB-R），以“2.1”項中合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為30 μL：2×Taq PCR Master Mix 15 μL，正反向引物各1 μL，模板cDNA 3 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環，72 ℃延伸8 min[16]。反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用試劑盒回收和純化目的片段，將純化后的產物與與入門載體pENTR/D-TOPO連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，均勻涂布在含有卡那霉素（Kan）抗性的LB平板上過夜培養，篩選陽性克隆進行菌液PCR，并將陽性克隆送至福州鉑尚生物有限公司測序。

2.3 BcASB基因的生物信息學分析

使用NCBI-ORF Finder平臺查找和分析基因的ORF，并將ORF翻譯成氨基酸序列。利用ExPASy-ProtParam tool軟件預測基因編碼蛋白的分子式、理論相對分子質量、等電點等各種理化性質；通過Plant-PLoc在線分析軟件初步預測蛋白的亞細胞定位；利用NetPhos 3.1 Server和NetOGlyc 4.0 Server分別對蛋白的磷酸化位點和糖基化位點進行預測分析；采用TMHMM Server v.2.0進行蛋白跨膜結構的預測；通過SignalP 4.1 Server對信號肽進行預測；分別使用在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL預測蛋白的二級結構和三維結構；通過Blast對馬藍ASB基因與芝麻、煙草、丹參、陸地棉等15種植物的同源序列進行分析，使用DNAMAN軟件進行同源序列的比對；利用MEGA 6.0軟件對預測的氨基酸序列與GenBank上的其他序列進行系統進化分析，采用NJ法（neighbor-joining）繪制系統進化樹，bootstrapping參數為1000個重復。

2.4 BcASB基因在馬藍中的誘導表達

采取馬藍的根、莖、葉，按照“2.1”項方法提取總RNA，以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，測定BcASB基因在馬藍不同器官中的表達模式。以β-actin為內參基因[17]，根據克隆獲得的BcASB基因序列，通過Primer Premier 5.0設計熒光定量PCR引物（表1）。分別用100 μmol/L的MeJA、SA、ABA、ETH 4種不同外源激素對馬藍植株進行脅迫處理，對處理后不同時間點（0、1、2、4、6、8、12、24、36、72 h）BcASB基因表達量進行熒光定量PCR表達分析。反應體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，正反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、20 s；72 ℃、20 s；40個循環，72 ℃、10 min。實驗設計3次技術重復，每個樣品3次重復，擴增曲線、溶解曲線、標準曲線由定量PCR儀軟件自動生成。反應結束后采用2-△△Ct方法[18-19]計算分析BcASB基因在不同處理下的相對表達量。

2.5 激素誘導下吲哚類生物堿靛藍、靛玉紅含量的測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為YMC C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.04%甲酸水溶液（B）（0.04%甲酸水溶液的制備：移液槍吸取400 μL甲酸置于含200 mL蒸餾水的容量為1000 mL藍蓋瓶中，加蒸餾水至1000 mL，搖勻后，超聲脫氣20 min）；檢測波長為289 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。梯度洗脫過程：0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～15 min，25%～30% A；15～20 min，30%～35% A；20～25 min，35%～15% A。色譜圖見圖1。

圖1 對照品混合溶液 (A) 和供試品溶液 (B) 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed solution (A) and test solution (B)

2.5.2 對照品溶液的制備 稱取靛藍對照品適量，精密稱定15 mg，置于10 mL量瓶中，精密加入含50%N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的甲醇溶液（超聲溶解30 min），配制成質量濃度為1.5 mg/mL的溶液，用0.45 μm和0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。稱取靛玉紅對照品適量，精密稱定10 mg，置于10 mL量瓶中，精密加入含50% DMF的甲醇溶液（超聲溶解5 min），配制成1.0 mg/mL的溶液，用0.45 μm和0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取經80 ℃烘干至恒定質量的馬藍葉片（不同激素、不同時間處理），粉碎機粉碎過40目篩，精密稱取粉末10 mg，置于10 mL量瓶中，加入50% DMF的甲醇溶液，45 ℃超聲溶解后定容，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.5.4 線性關系考察 精密吸取混標對照品溶液適量，加入甲醇進行倍比稀釋，分別得到對照品系列濃度。0.22 μm微孔濾膜濾過后，依據“2.5.1”項色譜條件，取10 μL進樣測定。以峰面積積分值（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得到各對照品的回歸方程，靛藍Y＝0.697 3X＋3.805 3，R2＝0.999 6，線性范圍為15.0～320.0 μg/mL；靛玉紅Y＝22.372 6X－6.805 3，R2＝0.999 7，線性范圍為5.0～50.0 μg/mL。

2.5.5 重復性試驗 按樣品測定方法對同一批號6份供試品樣品進行測定，計算靛藍、靛玉紅RSD分別為1.47%、1.65%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（記錄配制日期）依樣品測定色譜條件，分別于0、2、4、24 h注入液相色譜測定，計算靛藍、靛玉紅含量的RSD分別為1.59%、1.99。

2.5.7 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，按照上述色譜條件連續測定6次，考察日內精密度，測得靛藍、靛玉紅的RSD分別為1.77%、2.74%。

2.5.8 加樣回收率試驗 取重復性試驗同一批號樣品6份，各約0.5 g，分別精密加入靛藍、靛玉紅對照品溶液，制備成加樣供試品溶液，并分別測定和計算加樣回收率。結果顯示，靛藍、靛玉紅平均加樣回收率分別為97.3%、103.9%，RSD分別為1.17%、1.76%。

3 結果與分析

3.1 馬藍BcASB基因的克隆與序列分析

以馬藍總RNA反轉錄后獲得的cDNA為模板，用設計的特異引物BcASB-F、BcASB-R進行PCR擴增反應，結果顯示單一明亮的條帶（圖2），經測序后得到正確的序列，大小為765 bp（命名為BcASB），編碼256個氨基酸。將該基因的序列信息提交NCBI GenBank，登錄號為QCF61930.1，BcASB基因核苷酸和氨基酸序列如圖3所示。

圖2 PCR擴增BcASB基因Fig.2 PCR amplification of BcASB gene

3.2 馬藍BcASB蛋白的生物信息學分析

3.2.1 理化性質和細胞定位分析 通過ExPASy- ProtParam tool軟件推測該基因編碼蛋白的分子式為C1256H1956N342O369S9，相對分子質量為28 039.96，理論等電點（pI）為7.22，帶正電荷的殘基總數（Arg＋Lys）為24，帶負電荷的殘基總數（Asp＋G1u）為24，該蛋白不穩定性指數（II）為45.40，推測該蛋白屬于不穩定蛋白，脂肪指數為81.84，親水性的平均值（GRAVY）：-0.210，說明該蛋白屬于親水性蛋白。通過NetPhos 3.1 Server預測該蛋白共包含43個磷酸化位點，其中包括絲氨酸（serine）21個，蘇氨酸（threonine）13個和酪氨酸（tyrosine）9個；使用NetOGlyc 4.0 Server軟件預測該蛋白包含3個糖基化位點；通過Plant-PLoc在線軟件預測顯示BcASB蛋白定位于葉綠體。

3.2.2 信號肽及跨膜區的預測分析通過SignalP 4.1預測蛋白的信號肽，結果顯示無信號肽存在，說明該蛋白為非分泌型蛋白（圖4-A）；使用TMHMM Server v.2.0預測跨膜結構，結果顯示BcASB蛋白不包含跨膜區，為非膜蛋白（圖4-B）。

圖3 馬藍BcASB基因的核苷酸序列及對應的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence of BcASB gene in B.cusia

圖4 BcASB蛋白信號肽 (A) 和跨膜區 (B) 預測Fig.4 Prediction of signal peptide (A) and transmembrane domains (B) of BcASB protein

3.2.3 二級結構和三級結構預測 通過軟件SOPMA預測BcASB蛋白的二級結構，結果顯示α-螺旋50個，占19.53%；不規則卷曲117個，占45.70%；β-折疊25個，占9.77%；延伸鏈64條，占25.00%（藍色代表α-螺旋，紫色代表不規則卷曲，綠色代表β-折疊；紅色代表延伸鏈），這4個元件構成了BcASB蛋白的二級結構，其中α-螺旋和不規則卷曲為其主要結構元件，散布于整個蛋白中（圖5-A）。通過SWISS-MODEL軟件預測蛋白的三級結構，以谷氨酰胺酶為模板（SMTL ID：6qur.1.A），在第1～256位氨基酸處建模，三維模型覆蓋率為57.45%，序列相似性為0.48（圖5-B）。

圖5 BcASB蛋白二級結構 (A) 和三級結構 (B) 的預測Fig.5 Prediction of secondary structure (A) and tertiary (B) structure of BcASB protein

圖6 不同物種BcASB氨基酸序列多重比對Fig.6 Multiple alignments of amino acid sequence of BcASB form different species

3.2.4 多重序列比對及系統進化樹的構建 將BcASB基因編碼的蛋白序列提交至NCBI-Blastp，與其他植物ASB蛋白序列進行同源比對，結果顯示馬藍BcASB與上百種NCBI上登錄的植物有相似性，挑選其中15種與馬藍相似度較高的植物蛋白序列，利用DNAMAN軟件對其進行多重序列比對（圖6）。分析結果顯示馬藍Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek（QCF61930.1）與芝麻Sesamum indicumLinn.（XP_011070537.2）、丹參Salvia splendensBunge（TEY57190.1）、三果楊Populus trichocarpaCarr（XP_002314761.1）、胡楊Populus euphraticaOliv（XP_011024607.1）、月季Rosa chinensisJacp （XP_024193401.1）、陸地棉Gossypium hirsutumLinn（XP_016703097.1）等植物同源性達到72%～88%，總相似度達72.01%。利用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹（圖7），結果顯示馬藍BcASB蛋白與茄科一年或有限多年生草本植物辣椒的親緣關系最近，可聚為一支，與錦葵科陸地棉和海綿ASB蛋白親緣關系最遠。

3.3 BcASB基因的時空表達分析

3.3.1 BcASB基因在不同器官中的表達模式分析分別提取馬藍根、莖、葉的總RNA，qRT-PCR法測定BcASB基因在馬藍不同組織的表達模式，結果表明，BcASB在3種不同的器官中均有表達，但相對表達量存在一定差異，在葉和莖中表達量顯著高于根，表達量從高到低呈現出葉＞莖＞根，BcASB在葉中的表達量是莖的2.01倍，根的5.08倍（圖8）。

圖7 不同物種BcASB蛋白的系統進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of BcASB proteins from different species

圖8 BcASB基因在各器官中的相對表達量Fig.8 Relative expression of BcASB gene in various organs

3.3.2 不同外源激素對BcASB基因誘導表達的影響 對馬藍葉片進行了MeJA、SA、ABA、ETH 4種不同外源誘導物的脅迫處理，對不同時間點BcASB表達量進行qRT-PCR檢測。檢測結果表明，用MeJA處理后，馬藍BcASB基因表達量呈現先上升后下降的趨勢，在4、6、8、12 h時表達量顯著高于其他檢測點，在6 h達到峰值，與0 h處理點存在顯著差異，為0 h的5.89倍，隨后逐漸下降，在24、36、72 h相對表達量水平接近（圖9-A）。用SA處理后，BcASB基因表達量呈現先穩定后迅速上升的趨勢，在24 h達到峰值，表達量為0 h的3.2倍，而在24、36、72 h時BcASB基因的相對表達量顯著高于其他檢測點，說明SA對基因的調節更為持久，對植物代謝影響顯著（圖9-B）。用ABA處理后，BcASB基因表達量在8、12、24 h時相對表達量顯著高于其他檢測點，在0～4 h趨于穩定，在6 h小幅度上升，為0 h的1.5倍，8 h達到峰值，為0 h的4倍，隨后表達量逐漸下降，但在72 h表達量仍然高于0 h（圖9-C）。而用ETH處理后，BcASB基因表達量在6 h達到峰值，顯著高于其他檢測點，為0 h的1.58倍，24、36、72 h時基因的表達量水平與其他檢測點基本持平，沒有顯著性的差異，說明基因的相對表達量受ETH的影響較?。▓D9-D）。上述結果說明BcASB基因可以響應多種外源誘導子處理。

3.4 激素誘導下靛藍、靛玉紅含量測定分析

3.4.1 馬藍不同組織中靛藍、靛玉紅含量測定 對馬藍不同器官根、莖、葉中的吲哚類生物堿靛藍和靛玉紅含量進行了測定（圖10），研究結果顯示，靛藍、靛玉紅含量在馬藍葉、莖中的含量相差較大，靛藍在葉中的含量達到400.98 μg/g，是靛玉紅含量的10.1倍，靛藍在莖中的質量分數為650.58 μg/g，是靛玉紅含量的14倍，而在根中，兩者含量沒有顯著性差異；且靛藍在葉和莖中的含量顯著高于根，而靛玉紅在不同組織中的含量沒有顯著性差異。

3.4.2 不同激素處理的馬藍葉片中靛藍、靛玉紅含量測定 用MeJA處理馬藍葉片，采取處理后不同時間點的葉片，測定其含量的變化（圖11-A），HPLC檢測結果顯示，葉片中靛藍、靛玉紅的含量隨著時間的變化呈現先上升后下降的趨勢，靛藍在4、6、8、12 h時含量顯著高于其他檢測點，在6 h達到最大值，為786.35 μg/g，為0 h的1.96倍，在72 h下降到初始水平。靛玉紅的含量在6 h也達到最大值， 為66.38 μg/g，為0 h的2倍，在36 h下降到初始水平，但靛玉紅含量在各個檢測點沒有顯著性差異。

圖9 MeJA (A)、SA (B)、ABA (C)、ETH (D) 脅迫下BcASB基因在不同時間點的表達Fig.9 Expression of BcASB gene at different time points under stress of MeJA(A),SA(B),ABA (C),and ETH (D)

圖10 馬藍不同組織中靛藍、靛玉紅含量測定Fig.10 Determination of indigo and indirubin in different tissues of B.cusia

用SA處理后（圖11-B），實驗結果顯示，靛藍含量隨著時間的變化呈現先穩定后上升，再下降而后維持穩定的趨勢，在0～2 h靛藍含量維持穩定，4 h開始小幅上升，8 h含量達到最大值653.36 μg/g，且顯著高于其他檢測點，為0 h的1.69倍，8 h后，靛藍含量下降，并于24 h維持穩定水平，和初始含量一致。而靛玉紅含量隨著時間的增長，沒有顯著的變化，在6 h出現了小幅上升，但整體變化趨勢處于穩定水平，表明SA處理對馬藍葉片中靛玉紅含量的影響不大。

在ABA的處理下（圖11-C），靛藍含量隨著時間的變化呈現先上升后下降再上升的趨，在0～2 h呈現上升趨勢，4～12 h相對于2 h有下降的趨勢，但含量仍高于初始水平，24 h靛藍含量達到最大值600.58 μg/g，36、72 h呈現下降趨勢，但含量為0 h的1.25倍。而靛玉紅含量隨著時間變化沒有顯著差異，在24 h達到最大值60.36 μg/g，在72 h含量下降到初始水平。

在ETH處理下（圖11-D），靛藍含量在0～4 h呈現上升的趨勢，在4 h含量達到750.68 μg/g，隨后呈現下降的趨勢，在12 h含量又持續上升，在72 h達到最大值790.69 μg/g。靛玉紅含量同樣呈現先上升后下降再上升的趨勢，在0～4 h呈現上升趨勢，在4 h含量達到最大值80.69 μg/g，在6 h之后，含量呈現下降的趨勢，但在72 h含量上升至70.36 μg/g，為初始水平的1.5倍，總體上含量在各個檢測點沒有顯著性差異。

綜上所述，通過檢測不同外源誘導子處理下，不同時間點靛藍、靛玉紅積累量的變化，發現在某個時間檢測點靛藍、靛玉紅含量與0 h相比，均發生了顯著的上調，這與BcASB基因的表達量相一致，說明馬藍有效成分靛藍、靛玉紅積累量受基因表達的影響，進一步說明基因表達在馬藍有效成分的合成中發揮著關鍵作用。

4 討論

圖11 MeJA (A)、SA (B)、ABA (C)、ETH (D) 處理下馬藍葉片中靛藍、靛玉紅含量測定Fig.11 Determination of indigo and indirubin in leaves of B.cusia under MeJA (A),SA (B),ABA (C),and ETH (D) treatment

吲哚類生物堿（靛藍、靛玉紅等）作為植物次生代謝的重要產物之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、增強免疫等顯著藥理活性[20]。ASB是植物體內吲哚類生物堿合成途徑的關鍵酶之一，具有重 要的研究價值。近幾年，ASB的研究多集中在擬南芥、煙草這樣的模式植物中，在藥用植物的研究中鮮見報道。本研究立足于前期建立的馬藍轉錄組數據庫，克隆了馬藍BcASB基因，ORF區長為765 bp，編碼256個氨基酸，與芝麻的ASB同源性最高，可達88%。生物信息學分析結果顯示，BcASB蛋白相對分子質量為28 039.96，理論等電點為7.22，為非分泌型蛋白，因此不具有識別信號的功能。BcASB蛋白定位于葉綠體，這與一般報道的ASB蛋白的定位結果一致。同時對蛋白的親疏水性、信號肽、跨膜區、二級結構、三級結構作了詳細的分析，為馬藍BcASB基因提供了更多更詳盡的信息。

組織特異性表達結果表明，BcASB基因在馬藍不同的器官中均有表達，佐證了馬藍根、莖、葉均可入藥一說，且在葉中的表達量高于根和莖，這與已經報道的喜樹[14]的研究結果具有一致性，喜樹中AS亞基編碼的基因在其不同器官中均有表達，且在幼苗的發育過程中表達量迅速升高。在水稻[11]中，AS亞基編碼的基因在各組織中的表達模式卻有所不同，ASA1在花序中的表達量高于根和葉，而ASA2在各組織的表達量差異不大，這說明同源蛋白之間組織表達也具有一定的差異，可能與蛋白參與的功能相關。MeJA、ABA、SA、ETH在植物的代謝過程中發揮著重要的作用[21-22]。本研究對馬藍葉片進行了MeJA、ABA、SA、ETH這4種不同外源激素的脅迫處理，ASB表達量和馬藍有效成分靛藍、靛玉紅積累量均呈現出不同程度的上調，說明BcASB基因響應并介導外源誘導子對代謝的調控。這與擬南芥、水稻的表達情況相近。前期，Sun等[23]就在擬南芥的研究中發現MeJA會刺激鄰氨基苯甲酸合成酶基因的轉錄，從而促進擬南芥芽和根的生長。在水稻中也發現ASβ亞基編碼的基因也具有可誘導性[15]。同時，也有很多研究驗證了不同的信號誘導可以促進植物次生代謝產物的產生[24-25]。在馬藍等藥用植物中，其生物合成過程中的關鍵酶活性高低也會影響藥效成分的產量，因此，提高關鍵酶基因在植物中的表達也是提高藥用活性成分產量、提高中藥材品質的有效手段之一[26]。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，大多數的藥用植物已經涉及分子生物學領域，最活躍的研究領域就是與藥用活性成分形成相關的關鍵酶基因的克隆研究[27]。因此，本研究通過克隆馬藍鄰氨基苯甲酸合成酶BcASB基因，以及對其進行生物信息學分析、時空表達分析，并檢測有效成分積累量的變化，為后續構建基因超表達載體以及對該基因的功能研究奠定了基礎，同時對馬藍有效成分含量的提高具有積極作用，有助于更深入的闡釋馬藍吲哚類生物堿合成途徑和調控機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突