健骨丸對去勢大鼠骨質疏松性骨折愈合的影響

劉 煒，羅會盛，鄒愷平，王 娜，劉 順，施 敏

南京中醫藥大學附屬醫院 江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種與絕經有關的全身代謝性骨病，以骨量減少、骨組織顯微結構破壞繼而骨脆性增高和易發生骨折為特征[1-2]。我國是PMOP高發地區，女性絕經后10年內骨流失速度較快，60歲以上患有PMOP的女性中，30%～50%將經歷PMOP相關骨折，且這種趨勢逐年增高[3]。目前臨床上常用雌激素類、促進骨形成、抑制骨吸收等藥物治療PMOP相關骨折[4]。中醫理論認為腎生骨髓[5]。健骨丸為江蘇省中醫院院內制劑，其處方基本組成為鹿角、熟地黃、狗脊、黃柏、阿膠、三七、茯苓和六神曲，具有補腎健脾、填精益髓、活絡定痛的功效，臨床已使用近20年，其療效確切，常用于治療絕經期骨質疏松癥、男性骨質疏松癥等原發性骨質疏松癥。本研究通過建立大鼠絕經模型，研究健骨丸對去勢大鼠骨質疏松相關指標及骨折愈合的影響[6-7]，以期探討健骨丸對PMOP所致骨折的治療作用。

1 材料

1.1 動物

清潔級雌性SD大鼠，12周齡，體質量200～220 g，由浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號SYXK 2017-0069。動物飼養于SPF級飼養室，12 h晝夜交替，溫度（21±2）℃，濕度（50±10）%，自由進食飲水。動物實驗經江蘇省中醫院倫理委員會批準（批準號2020DW-34-01）。

1.2 藥品與試劑

健骨丸（質量標準JSZBZ20090801Z，批號1912010）由江蘇省中醫院制劑部提供，主要含鹽酸小檗堿和三七皂苷；仙靈骨葆膠囊（批號191022103）購自貴州同濟堂制藥有限公司；鈣測定試劑盒（批號20190111）、血清無機磷測定試劑盒（批號20190111）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測定試劑盒（批號20190106）購自南京建成生物工程研究所；人血清雌二醇（estradiol，E2）放免試劑盒、血清骨鈣素（bone gla protein，BGP）放免試劑盒和降鈣素（calcitonin，CT）放免試劑盒購自北京華英生物技術研究所；其他試劑均為市售分析純。

1.3 儀器

Power wave x340酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Discover W型雙能X線骨密度測量儀（美國Hologic公司）；Eclipse E100型光學顯微鏡（日本尼康公司）；5424R型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

SD大鼠隨機分為對照組、模型組、仙靈骨葆膠囊（300 mg/kg，相當于臨床等效劑量）組和健骨丸低、中、高劑量（150、300、450 mg/kg，分別相當于臨床最大劑量的0.5、1.0、1.5倍）組，各組再分為給藥15 d以及30 d 2組。除對照組外，其余各組進行雙側卵巢切除手術，3個月后右后腿脛骨機械性骨折，建立去勢骨質疏松性骨折模型[7]。骨折手術當天，各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續15、30 d。

2.2 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠血清中E2、CT、BGP、血鈣、血磷水平和AKP活性的影響

分別于給藥15、30 d，大鼠乙醚麻醉后頸總動脈采血致死，全血于室溫放置，分層后4000 r/min離心10 min，取上層血清，按試劑盒說明書檢測血清中E2、CT、BGP、血鈣、血磷水平和AKP活性。

2.3 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠脛骨影像學及骨密度的影響

分別于給藥15、30 d，采用雙能X線骨密度測量儀對各組大鼠右脛骨進行X-射線掃描，并測定骨密度。

2.4 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠骨折處病理變化的影響

取給藥30 d大鼠骨折處及其周圍組織，于10%福爾馬林中固定，脫鈣后常規石蠟包埋、切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下拍照并觀察骨折周圍修復情況。

2.5 統計方法

使用Graphpad Prism 7軟件進行數據統計，組間差異使用One way ANOVA法進行分析。

3 結果

3.1 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠血清中E2、CT、BGP、血鈣、血磷水平和AKP活性的影響

E2是由卵巢內的卵泡細胞分泌的一種甾體雌激素，雌激素降低是導致PMOP最主要的原因[8-9]。如圖1-A所示，與模型組比較，給藥15 d，健骨丸高劑量組血清E2水平顯著升高（P＜0.01）；給藥30 d，健骨丸各劑量組血清E2水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

CT是一種鈣調節激素，能夠通過抑制破骨細胞的增殖并降低破骨細胞的活性，從而降低骨吸收和骨丟失[10]。如圖1-B所示，與模型組比較，給藥15 d，各給藥組血清CT水平均顯著升高（P＜0.05）；給藥30 d，健骨丸各劑量組血清CT水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

BGP主要由成骨細胞、骨細胞、骨肉瘤細胞等骨形成性細胞產生，血中BGP水平可特異性反映成骨細胞的活性[11]。如圖1-C所示，與模型組比較，給藥15 d，仙靈骨葆膠囊組血清BGP水平顯著升高（P＜0.05）；給藥30 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸低劑量組血清BGP水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

AKP是骨細胞功能分化的指標，其活性可作為成骨細胞分化的特異性標志。臨床常用AKP活性評價成骨細胞分泌功能[12]。如圖1-D所示，與模型組比較，給藥15 d，健骨丸低、高劑量組血清AKP活性顯著升高（P＜0.05、0.01）；給藥30 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸低劑量組血清AKP活性顯著升高（P＜0.05、0.001）。

圖1 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠血清中E2 (A)、CT (B)、BGP (C) 水平、AKP (D) 活性、血鈣 (E) 和血磷 (F) 水平的影響 ( ±s,n = 6)Fig.1 Effect of Jiangu Pill on E2 (A),CT (B),BGP (C) levels,AKP (D) activity,blood calcium (E) and blood phosphorus (F) levels in serum of ovariectomized osteoporotic fracture rats ( ±s,n = 6)

在骨折愈合過程中，局部環境的微量元素代謝活躍，其中鈣和磷的沉積是一個關鍵步驟，兩者處于動態平衡的狀態[13]。如圖1-E、F所示，與模型組比較，給藥15 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸各劑量組血鈣水平均顯著升高（P＜0.05、0.001），健骨丸低、中劑量組血磷水平均顯著升高（P＜0.01、0.001）；給藥30 d，仙靈骨葆膠囊組和健骨丸低、中劑量組血鈣水平均顯著升高（P＜0.05），各給藥組血磷水平均顯著升高（P＜0.05）。

3.2 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠脛骨影像學及骨密度的影響

骨質疏松性骨折的愈合過程通常包括纖維、軟骨及骨性骨痂的形成。骨痂的形成對骨折愈合至關重要，反映了骨組織再生修復的自然規律，也是臨床判斷骨折愈合程度的重要依據[14-15]。如圖2所示，給藥15 d，各給藥組斷面有骨痂生成；給藥30 d后，各給藥組斷面有大量骨痂形成，其中健骨丸中、高劑量組生成骨痂量多于模型組。健骨丸各劑量組骨折愈合情況較模型組有明顯改善。

圖2 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠脛骨影像學的影響Fig.2 Effect of Jiangu Pill on tibia imaging in ovariectomized osteoporotic fracture rats

骨密度即骨骼礦物質密度，反映骨骼強度，也是診斷骨質疏松癥、骨質疏松性骨折以及骨折愈合程度的重要指標[16-17]。如圖3所示，給藥15、30 d，與模型組比較，各給藥組骨密度均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

3.3 健骨丸對去勢骨質疏松性骨折大鼠骨折處病理變化的影響

如圖4所示，與模型組相比，健骨丸各劑量組斷端骨痂中骨性骨痂的成分增多，骨小梁的粗細及骨髓腔的大小與對照組相似。

圖3 健骨丸對去勢骨質疏松骨折大鼠骨密度的影響 ( ±s,n = 6)Fig.3 Effect of Jiangu Pill on bone density in ovariectomized osteoporotic fracture rats ( ±s,n = 6)

圖4 健骨丸對去勢骨質疏松骨折大鼠骨折處病理變化的影響 (HE,×40)Fig.4 Effect of Jiangu Pill on pathological changes of fractures in ovariectomized osteoporotic fracture rats (HE,× 40)

4 討論

在中醫理論中，女性絕經主要是因腎氣漸衰、沖任不足、天癸將竭、精氣虧虛、陰陽失衡所致。中醫理論認為腎與骨有著極其密切的聯系，《素問·陰陽應象大論》曰：“腎生骨髓”，即腎中精氣充足，骨髓得以滋養，骨則強壯[18-19]。

健骨丸為江蘇省中醫院臨床驗方制成的院內制劑，其處方基本組成為鹿角、熟地黃、狗脊、黃柏、阿膠、三七、茯苓和六神曲。方中鹿角、狗脊共為君藥，鹿角性溫，歸肝、腎經，有溫腎陽、強筋骨之效；狗脊性甘、寒，歸肝、腎經，有補肝腎、強腰脊之功效；熟地黃、阿膠共為臣藥，熟地黃性微溫，歸肝、腎經，有填精益髓之效，為補腎陰之要藥；阿膠性平，歸肺、肝、腎經，有補血、滋陰、止血之功效；佐以黃柏苦寒堅腎，三七散瘀止痛，茯苓、六神曲健脾寧心，諸藥合用，共奏補腎健脾、填精益髓、活絡定痛之功，在臨床上對絕經期骨質疏松癥有確切療效。

本研究以仙靈骨葆膠囊為陽性對照藥物，通過建立去勢大鼠模型，探討健骨丸對去勢大鼠骨質疏松性骨折愈合的影響。結果顯示，健骨丸能夠增加去勢骨質疏松模型大鼠血清E2水平。雌激素降低是導致PMOP的重要原因之一，E2是活性最強的雌激素，E2水平的降低會抑制成骨細胞活性并增強破骨細胞活性，導致骨密度降低，骨量丟失增多。健骨丸通過升高E2水平，增加骨密度，促進成骨細胞增殖，抑制骨吸收，保護骨組織，防止骨丟失。在骨折愈合過程中檢測AKP具有重要意義，AKP的含量變化可反映骨折區細胞增殖的程度以及骨折愈合演進的狀況。血中40%～50% AKP來源于骨，AKP的活性可反映骨細胞尤其是新形成的成骨細胞的活性及狀態。本研究結果顯示，健骨丸可提高血中AKP活性，提示健骨丸可以提高成骨細胞活躍度，促進骨形成增加。血中CT、BGP水平也是反映成骨細胞活性的特異性指標，本研究結果顯示，健骨丸可以提高血清CT、BGP水平，促進骨形成；此外，健骨丸能夠增加血鈣、血磷水平，促進骨基質的鈣化，形成骨質[6,20-22]。

結合X-射線掃描、骨密度及病理組織學結果可知，健骨丸可以通過提高骨折端骨密度來增加骨骼強度，從而促進骨折愈合；同時，骨折斷端已由增生的纖維結締組織、軟骨、松質骨形成的骨痂連接。與對照組比較，模型組大鼠骨痂內松質骨骨髓腔較大，表現為明顯的骨質疏松現象；各給藥組骨髓腔形態基本正常，由去勢誘導的骨質疏松癥狀明顯緩解；健骨丸各劑量組骨小梁表面可見活躍增生的成骨細胞，小梁之間已有骨髓腔形成，部分增生的結締組織內尚可見豐富的毛細血管，骨痂內軟骨數量不等。健骨丸可使機械損傷的骨折斷端骨痂明顯增多，成骨細胞增生活躍，骨折愈合良好[8,23]。健骨丸各劑量組未體現明顯的劑量相關性，這可能是受多組分的藥物代謝影響。本研究結果提示，健骨丸對于其他適應癥的臨床指導用量（成人10～15 g/d）也可作為修復絕經引起的骨質疏松性骨折的臨床使用劑量。

本研究通過測定去勢大鼠血清中E2、CT、BGP、AKP、血鈣、血磷等生化指標，結合X-射線掃描、骨密度檢測以及病理組織學方法，表明健骨丸具有促進絕經引起的骨質疏松性骨折的骨形成以及骨折愈合的功效。課題組后續將深入探究其可能的作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突