桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的藥效學(xué)研究

徐志紅，陳磊垚，許 立，張 嫻

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014

骨質(zhì)疏松癥作為一種多發(fā)于中老年人的慢性退行性疾病，短時(shí)期內(nèi)不易被發(fā)現(xiàn)，患者若不及時(shí)治療，會(huì)造成胸、腰椎、肱骨等多處骨折。近年來(lái)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前臨床常用抑制破骨細(xì)胞的雙膦酸鹽類、抑制骨吸收的降鈣素類以及雌激素補(bǔ)充劑類藥物治療骨質(zhì)疏松癥[1]，以上藥物長(zhǎng)期服用均具有較大的不良反應(yīng)，因此尋求更好的替代藥物或聯(lián)合用藥方案具有重要的意義。

中醫(yī)以補(bǔ)腎益精、活血化瘀為基本方針治療骨質(zhì)疏松癥[2]。桃紅四物湯為經(jīng)典名方，由當(dāng)歸、熟地、川芎、白芍、桃仁、紅花6味中藥配伍組成，具有活血化瘀、養(yǎng)血行氣的功效[3]。臨床研究表明，桃紅四物湯對(duì)骨折后的愈合具有較好的療效，常用于骨質(zhì)疏松性骨折術(shù)后的聯(lián)合用藥治療[4-5]。樊梅等[6]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過(guò)69個(gè)活性成分作用于5346個(gè)靶點(diǎn)治療骨質(zhì)疏松癥，具有“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的特點(diǎn)。楊卓等[7]發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯中單一成分對(duì)骨折大鼠軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)及骨小梁的形成具有促進(jìn)作用。目前尚未見針對(duì)桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的全面藥效學(xué)研究，本研究旨在明確桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，3月齡，體質(zhì)量（300±20）g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0006。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)202006010）。

1.2 藥材

當(dāng)歸（批號(hào)200702，甘肅）、熟地（批號(hào)201002，河南）、川芎（批號(hào)201201，四川）、白芍（批號(hào)190501，安徽）、桃仁（批號(hào)201113，河北）、紅花（批號(hào)200810，新疆）購(gòu)自南京鶴齡藥事服務(wù)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鄒立思實(shí)驗(yàn)員鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根、玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖、毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、薔薇科植物桃Purnus persica(L.) Batsch的干燥成熟種子、菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。

1.3 藥品與試劑

對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)wkq19032211，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)wkq18041905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、苦杏仁苷（批號(hào)wkq19070203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芍藥苷（批號(hào)wkq18032205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）和阿魏酸（批號(hào)wkq16080219，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；對(duì)照品梓醇（批號(hào)110808-201819，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、地黃苷A（批號(hào)10109-201612，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）和綠原酸（批號(hào)110563-201506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自南昌貝塔生物科技有限公司；仙靈骨葆膠囊（批號(hào)1907053，0.5 g/粒）購(gòu)自貴州同濟(jì)堂制藥有限公司；骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）抗體（批號(hào)GR3210856）、核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）抗體（批號(hào)GR294319）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.4 儀器

e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；3367型雙立柱臺(tái)式電子試驗(yàn)機(jī)（美國(guó)Instron公司），小動(dòng)物活體微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro computed tomography，Micro-CT）影像系統(tǒng)（德國(guó)Bruker公司）。

2 方法

2.1 桃紅四物湯的制備

取熟地黃12 g、川芎6 g、當(dāng)歸9 g、白芍9 g、紅花6 g和桃仁9 g，加入10倍量水煎煮60 min，濾過(guò)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至含生藥量1 g/mL的溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取梓醇、沒(méi)食子酸、地黃苷A、羥基紅花黃色素A、綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸對(duì)照品各1 mg，分別置于1 mL量瓶，加入適量甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單一對(duì)照品母液。精密吸取適量單一對(duì)照品母液，配制成混合對(duì)照品溶液。

2.3 桃紅四物湯中化學(xué)成分的驗(yàn)證

按照李雙雙等[8]方法分析桃紅四物湯中的化學(xué)成分。色譜條件：Hypersil GOLD AQ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3 min，4% A；3～10 min，4%～10% A；10～18 min，10%～23% A；18～23 min，23%～28% A；23～30 min，28%～40% A；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

2.4 造模、分組與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、仙靈骨葆膠囊（0.4 g/kg）以及桃紅四物湯低、高劑量（0.2、0.4 g/kg）組，每組8只。模型組和各給藥組行雙側(cè)卵巢去除術(shù)，對(duì)照組只摘除附在卵巢周圍少量脂肪組織。桃紅四物湯以蒸餾水分別配制成質(zhì)量濃度為0.02、0.04 g/mL的溶液，仙靈骨葆膠囊以蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的溶液。術(shù)后1周，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)3個(gè)月。

2.5 骨標(biāo)本的制備

給藥結(jié)束后，大鼠ip戊巴比妥鈉麻醉處死，取出完整的左右側(cè)股骨、脛骨，充分剔除殘余結(jié)締組織及肌肉，脛骨浸泡于4%福爾馬林中；股骨以0.9%氯化鈉溶液沖洗，以經(jīng)0.9%氯化鈉溶液浸泡的紗布包裹，外層再以錫紙包裹，于 -80 ℃冰箱保存。

2.6 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨載荷能力的影響

股骨于室溫下解凍，用游標(biāo)卡尺測(cè)定各組大鼠股骨中段外徑，并計(jì)算截面積。將各組大鼠股骨置于雙立柱臺(tái)式電子試驗(yàn)機(jī)，于股骨中段施加載荷直至股骨斷裂，支點(diǎn)跨距20 mm，加載速度2 mm/min[9]，軟件自動(dòng)記錄最大載荷。

2.7 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨病理變化的影響

各組大鼠脛骨脫鈣后切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）或番紅固綠染色，經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)及骨丟失情況。堿性染料番紅O可以與骨組織中嗜酸性軟骨糖胺聚糖結(jié)合，顯微鏡下呈現(xiàn)紅色或橘色。

2.8 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨密度的影響

取浸泡于4%福爾馬林中的右側(cè)脛骨，置于PBS溶液中，采用Micro-CT影像系統(tǒng)對(duì)各組大鼠脛骨進(jìn)行骨密度分析，分辨率為35 μm，Source Voltage為60 kV，Source Current為385 μA。采用軟件對(duì)脛骨骨小梁與骨組織面積比、骨小梁數(shù)量、骨小梁寬度、骨小梁分離度和骨密度進(jìn)行分析[10]。

2.9 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞的影響

各組大鼠脛骨脫鈣后切片，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）和蘇木素染色，經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察脛骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量[11]。

2.10 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨組織中OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響

各組大鼠脛骨脫鈣后切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、非特異性封閉、免疫反應(yīng)、DAB顯色、蘇木素復(fù)染后，于顯微鏡下觀察并拍照，檢測(cè)脛骨中OPG和RANKL蛋白表達(dá)情況。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPASS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，兩組均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯提取物主要成分驗(yàn)證

如圖1所示，桃紅四物湯含有梓醇、沒(méi)食子酸、地黃苷A、羥基紅花黃色素A、綠原酸、苦杏仁苷、芍藥苷和阿魏酸8種特征性成分，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，可保證提取物質(zhì)量可控。

圖1 對(duì)照品溶液 (A) 與桃紅四物湯 (B) 的色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference solution (A) and Taohong Siwu Decoction (B)

3.2 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨載荷能力的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨最大載荷、最大應(yīng)力和彈性載荷均顯著降低（P＜0.01），提示骨質(zhì)疏松模型制備成功；與模型組比較，桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨最大載荷、最大應(yīng)力和彈性載荷均顯著升高（P＜0.05、0.01），桃紅四物湯低劑量組大鼠股骨最大載荷顯著升高（P＜0.05），仙靈骨葆膠囊組大鼠股骨最大載荷和彈性載荷顯著升高（P＜0.05），表明高劑量桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松引起的股骨載荷能力降低具有較好的提升作用。

3.3 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨病理變化的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脛骨近端骨丟失嚴(yán)重，骨小梁稀疏、斷裂程度高，表明骨質(zhì)疏松模型制備成功。各給藥組脛骨骨丟失程度改善，骨小梁數(shù)量增加，連接增多，骨小梁分離度降低。

表1 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨載荷能力的影響 ( ±s,n = 8)Table 1 Effect of Taohong Siwu Decoction on load capacity of femur in osteoporotic rats ( ±s,n = 8)

表1 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨載荷能力的影響 ( ±s,n = 8)Table 1 Effect of Taohong Siwu Decoction on load capacity of femur in osteoporotic rats ( ±s,n = 8)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) 最大載荷/N 最大應(yīng)力/MPa 彈性載荷/N 對(duì)照 — 235.92±42.07 224.21±29.30 6.58±1.13 模型 — 177.24±29.49## 173.23±23.47## 4.24±0.57## 仙靈骨葆膠囊 0.4 207.61±16.96* 197.58±35.84 5.26±0.90* 桃紅四物湯 0.4 217.65±30.42* 203.98±25.54* 5.41±0.48** 0.2 203.74±18.41* 197.85±33.09 5.04±0.69

3.4 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨密度的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脛骨骨缺失明顯；與模型組比較，各給藥組骨丟失程度改善。如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脛骨骨密度、骨小梁與骨組織面積比、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量顯著降低（P＜0.05、0.01），骨小梁分離度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠脛骨骨密度、骨小梁與骨組織面積比、骨小梁數(shù)量顯著升高（P＜0.05、0.01），骨小梁分離度顯著降低（P＜0.01）；桃紅四物湯高劑量組和仙靈骨葆膠囊組大鼠骨小梁寬度顯著升高（P＜0.05），表明桃紅四物湯能夠提升骨質(zhì)疏松大鼠骨密度，恢復(fù)骨小梁功能及結(jié)構(gòu)。

3.5 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞的影響

如圖5所示，模型組大鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增加，各給藥組破骨細(xì)胞數(shù)量減少，表明桃紅四物湯能夠減輕溶骨性病變，抑制破骨細(xì)胞功能。

圖2 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨病理變化的影響 (×1.5)Fig.2 Effect of Taohong Siwu Decoction on pathological changes of tibia in osteoporotic rats (× 1.5)

圖3 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨小梁的影響Fig.3 Effect of Taohong Siwu Decoction on trabecular of tibia in osteoporotic rats

圖4 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨形態(tài)學(xué)參數(shù)的影響 ( ±s,n = 8)Fig.4 Effect of Taohong Siwu Decoction on morphological parameters of tibia in osteoporotic rats ( ±s,n = 8)

圖5 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨組織中破骨細(xì)胞的影響 (×200)Fig.5 Effect of Taohong Siwu Decoction on osteoclasts of tibia in osteoporotic rats (× 200)

3.6 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨組織中OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與模型組比較，各給藥組脛骨組織中OPG陽(yáng)性表達(dá)增加，骨小梁表面RANKL陽(yáng)性表達(dá)降低，表明桃紅四物湯可以通過(guò)正向調(diào)節(jié)OPG與RANKL比值，促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能，并抑制破骨細(xì)胞的成熟及分泌。

4 討論

圖6 桃紅四物湯對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠脛骨組織中OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響 (×400)Fig.6 Effect of Taohong Siwu Decoction on OPG and RANKL protein expressions of tibia in osteoporotic rats (× 400)

本研究采用雙側(cè)去卵巢法建立骨質(zhì)疏松模型， 選取骨密度、骨小梁數(shù)目等多個(gè)標(biāo)志性指標(biāo)評(píng)估骨質(zhì)疏松造模是否成功[12]。骨密度是衡量骨骼強(qiáng)度的重要參數(shù)之一，也是診斷是否存在骨質(zhì)疏松的重要指標(biāo)之一[13]。而骨骼強(qiáng)度除了用骨密度含量進(jìn)行衡量，骨小梁的承載負(fù)荷能力對(duì)骨內(nèi)傳導(dǎo)及分解外力載荷也尤為重要[14]。大鼠切除雙側(cè)卵巢3個(gè)月后，骨密度顯著降低，骨小梁數(shù)量顯著減少，骨小梁分離度明顯提高，表明骨質(zhì)疏松模型制備成功。

桃紅四物湯為經(jīng)過(guò)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)典中藥驗(yàn)方，臨床上常用于治療骨折、腰腿痛、骨質(zhì)疏松癥等骨科疾病，目前針對(duì)桃紅四物湯的相關(guān)報(bào)道為臨床經(jīng)驗(yàn)治療且多為輔助用藥，并未對(duì)其藥效進(jìn)行單獨(dú)探討。本研究通過(guò)ig桃紅四物湯單方，探究桃紅四物湯對(duì)慢性骨質(zhì)疏松病變各類指標(biāo)的正向改善作用。HPLC結(jié)果表明本研究制備的桃紅四物湯主要成分與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，其質(zhì)量可控。

本研究通過(guò)對(duì)大鼠股骨生物力學(xué)檢測(cè)，確定桃紅四物湯能夠明顯增加骨質(zhì)疏松大鼠股骨的載荷能力；采用HE和番紅固綠染色觀察大鼠脛骨切片，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯能夠減少骨丟失面積，減小骨小梁間隙；Micro-CT結(jié)果顯示，桃紅四物湯能夠升高骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、骨小梁與骨組織面積比、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)量，降低骨小梁分離度，尤以桃紅四物湯高劑量組療效最佳。通常骨丟失主要是骨吸收和骨生成的失衡，破骨細(xì)胞是異常骨重建的主要功能細(xì)胞，其功能亢進(jìn)是引發(fā)骨質(zhì)疏松癥等多種退行性病變的直接原因[15]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，RANK/RANKL/OPG通路是調(diào)節(jié)骨質(zhì)的形成和吸收過(guò)程的重要通路，也是近年骨質(zhì)疏松病理及藥理研究的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯對(duì)破骨細(xì)胞生成具有抑制作用，可能主要通過(guò)上調(diào)OPG與RANKL比值，從而減少破骨細(xì)胞的成熟及分泌。

綜上所述，桃紅四物湯對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松癥具有良好的治療效果，可以通過(guò)抑制破骨細(xì)胞功能進(jìn)而阻止骨質(zhì)疏松的惡化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突