基于miRNA測序技術探討黃芪-丹參藥對干預自發性高血壓大鼠腎損害的機制研究

劉 瑤，李 偉

1.山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250355

2.山東中醫藥大學附屬醫院 腎內科，山東 濟南 250014

高血壓和腎臟病密切相關，互為病因和加重因素[1]。長期持續的原發性高血壓，可引發腎小動脈肌內膜肥厚、管腔狹窄、細小動脈玻璃樣變，繼發腎實質缺血性損害，進一步加劇血壓升高，二者形成惡性循環。高血壓腎損害是終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）的獨立危險因素和主要病因。因此，探討高血壓腎損害的新型防治策略，有助于降低ESRD及其并發癥的發生率。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類進化上非常保守、長度介于21～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，通過其種子序列（5’端的2～8位核苷酸序列）與靶mRNA 3’非翻譯端互補靶序列匹配，介導mRNA的降解或抑制蛋白質的翻譯，進而調節相應基因表達。研究發現，miRNA不僅可以通過影響多種細胞活性和細胞增殖、凋亡、分化、遷移和死亡等生物學過程，從而在高血壓發生發展中發揮重要作用[2-3]，也可作為糖尿病腎病、免疫性腎臟疾病、腎細胞癌等多種腎臟疾病的潛在治療靶點[4-6]。

山東中醫藥大學附屬醫院李偉教授結合自身多年臨床經驗，主張氣虛血瘀貫穿高血壓腎損害始終，臨床采用補氣活血法治療，可減少患者尿微量白蛋白的排泄，保護腎功能。黃芪-丹參作為補氣活血的典型代表藥對，在調控血壓、舒張血管、抗凝、抗氧化、調節炎性反應等方面具有多重功效[7]。本課題組前期研究表明，黃芪-丹參藥對能夠降低自發性高血壓大鼠的血壓及雙腎血流阻力指數（resistance index，RI），提高腎組織一氧化氮（nitric oxide，NO）水平及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，延緩高血壓腎損害的發展進程[8-9]。本研究旨在通過miRNA測序技術，從轉錄組學角度探索黃芪-丹參藥對在自發性高血壓大鼠腎組織中的直接作用靶點，探討其改善高血壓腎損害的作用機制，為中藥防治高血壓腎損害提供依據。

1 材料

1.1 動物

24周齡SPF級雄性自發性高血壓大鼠18只，同周齡WKY大鼠9只，體質量280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。動物于溫度22～24 ℃、濕度50%～70%條件下適應性飼養1周，自由進食飲水。動物實驗經山東中醫藥大學倫理委員會批準（批準號SDUTCM20210305023）。

1.2 藥品與試劑

2 g黃芪中藥配方顆粒（批號18013991）相當于飲片5 g，1 g丹參中藥配方顆粒（批號18005862）相當于飲片10 g，均由山東中醫藥大學附屬醫院提供；QIAseq miRNA Library Kit、miRNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司；MiPure Cell/Tissue miRNA Kit（批號7E242G8）購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（批號638313）、TB GreenTMEx TaqTMⅡ Kit（批號RR820A）購自Takara生物技術有限公司。

1.3 儀器

MRBP-RMC大鼠多通道無創血壓測量系統（美國IITC公司）；Eclipse E100正置光學顯微鏡（日本Nikon公司）；Qubit?3.0 Fluorometer（美國Life Technologies公司）；Nanodrop One分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 2100生物分析儀（美國Agilent公司）；Hiseq Xten測序儀（美國Illumina公司）；Light Cycler480 II qRT-PCR儀（德國Roche公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

取WKY大鼠9只作為對照組，將自發性高血壓大鼠隨機分為模型組和黃芪-丹參藥對（3.4 g/kg）組，每組9只。根據本課題組前期研究[10]，黃芪、丹參飲片用量分別為5.09、2.55 g/kg，分別將黃芪、丹參配方顆粒用量定為2.036、0.255 g/kg，藥物以0.9%氯化鈉溶液溶解。各給藥組ig藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續4周。

2.2 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠血壓的影響

每周采用無創尾動脈加壓法測量血壓，記錄每只大鼠清醒狀態下尾動脈的收縮壓與舒張壓，連續測量3次。

2.3 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠腎組織病理變化的影響

給藥結束后，大鼠ip 3%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）過量麻醉處死，取腎組織，于中性多聚甲醛中固定48 h，切片（厚4 μm）后石蠟包埋，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，以中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 各組大鼠腎組織差異表達miRNA分析

2.4.1 腎組織RNA的抽提與純化 隨機選取各組大鼠各3只，按照試劑盒說明書提取腎組織RNA，用生物分析儀進行質量檢測，采用Qubit?3.0 Fluorometer和Nanodrop One分光光度計進行定量分析。

2.4.2 文庫構建與高通量測序 使用QIAseq miRNA Library Kit構建雙端測序文庫。純化產物合成cDNA文庫，繼而進行定量檢測，以確認插入片段的大小。通過cBot生成簇，將文庫稀釋至10 pmol/L，在Illumina Hiseq Xten測序平臺上測序。

2.4.3 基因表達的數據分析 將每個具有miRNA序列的樣品讀長與已有miRNA數據庫和新miRNA的預測結果進行比較，計算miRNA表達水平，并通過CPM篩選miRNA。使用DESeq軟件分析樣品miRNA表達并篩選出P＜0.05、倍數變化（fold change，FC）＞1.5或＜0.67的差異表達miRNA。

2.5 qRT-PCR驗證差異表達miRNA

選擇5個差異表達miRNA（miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-125b-1-3p）進行qRT-PCR驗證。使用MiPure Cell/Tissue miRNA Kit提取各組大鼠腎組織miRNA，用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit逆轉錄純化的miRNA，合成cDNA。根據TB GreenTMEx TaqTMⅡ Kit試劑盒說明書進行qRT-PCR分析。以U6為內參，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 差異表達miRNA靶基因的預測、差異表達miRNA與靶基因網絡的構建

利用miRanda算法從miRNA-mRNA序列匹配情況及能量穩定性方面綜合預測差異表達miRNA靶基因。運用Cytoscape軟件構建差異表達miRNA與相應靶基因的網絡圖。

2.7 統計分析

采用SPSS 17.0軟件分析數據，數據以±s表示，兩組用獨立樣本的t檢驗比較。

3 結果

3.1 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠血壓的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠收縮壓和舒張壓顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥后第2周，黃芪-丹參藥對組大鼠收縮壓顯著降低（P＜0.05），給藥后第3、4周，收縮壓和舒張壓均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

3.2 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠腎組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組可見腎小球體積正常，系膜區未見明顯增生，系膜基質正常，未見腎小球硬化，腎小管上皮細胞形態正常；模型組可見腎小球體積輕度增大，分葉明顯，系膜區增生，系膜基質增多，伴明顯的中性粒細胞及其他炎性細胞浸潤，輕度腎小管萎縮；黃芪-丹參藥對組可見腎小球體積輕度增大，分葉不明顯，系膜區輕度增生，伴輕度中性粒細胞和其他炎性細胞浸潤。

表2 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠血壓的影響 ( ±s,n = 9)Table 2 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on blood pressure of spontaneously hypertensive rats ( ±s,n = 9)

表2 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠血壓的影響 ( ±s,n = 9)Table 2 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on blood pressure of spontaneously hypertensive rats ( ±s,n = 9)

與同組給藥前比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與對照組同時間比較：##P＜0.01；與模型組同時間比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 (1 mm Hg＝133 Pa)*P < 0.05 **P < 0.01 vs same group before administration; ##P < 0.01 vs control group at the same time; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group at the same time (1 mm Hg = 133 Pa)

組別 劑量/(g·kg-1) 血壓類型 血壓/mm Hg 給藥前 給藥后第1周 給藥后第2周 給藥后第3周 給藥后第4周 對照 — 收縮壓 132.89±11.42 132.17±10.76 131.25±10.12 130.69±9.96 129.45±8.76 舒張壓 109.41±10.17 106.78±11.32 104.65±9.93 102.89±9.57 100.18±10.08 模型 — 收縮壓 198.76±5.72## 196.89±5.98## 194.37±4.97## 192.63±4.68## 191.75±5.05## 舒張壓 171.38±6.64## 169.12±5.43## 166.54±6.12## 164.19±5.36## 163.07±4.91## 藥對 3.4 收縮壓 199.24±4.46 190.63±3.98 183.92±4.09*△ 179.12±4.14**△△ 173.42±4.96**△△ 舒張壓 170.57±5.48 165.88±7.12 161.77±6.34 158.48±5.96*△ 150.17±6.99**△△

圖1 黃芪-丹參藥對對自發性高血壓大鼠腎組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.1 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on kidney pathological changes of spontaneously hypertensive rats (HE,× 100)

3.3 各組大鼠腎組織差異表達miRNA分析

如圖2、3所示，與對照組比較，模型組篩選得到115個差異表達miRNA，其中68個miRNA上調、47個miRNA下調，最具顯著性差異的miRNA為miR-219a-2-3p；與模型組比較，黃芪-丹參藥對組篩選得到91個差異表達miRNA，其中67個miRNA上調、24個miRNA下調，最具顯著性差異的miRNA為miR-874-5p。

如表3所示，miR-219a-5p、miR-3585-5p、miR-142-5p在模型組表達上調，而在黃芪-丹參藥對組表達下調，推測這3個基因的表達可能與黃芪-丹參藥對的調控作用相關，因此將其作為后續研究的篩選靶點。

3.4 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證

如圖4所示，各組大鼠腎組織miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3pmRNA相對表達量與miRNA測序結果趨勢一致，提示miRNA測序結果真實可靠，可用于進一步的深層次數據分析。

3.5 差異表達miRNA的功能分析

miRNA不編碼蛋白質，但可通過調控mRNA發揮作用，因此，本研究通過對miRNA靶基因的預測，使用基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析分別對靶基因進行富集，以探討miRNA在細胞內的潛在調控作用。GO功能分析包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）3個部分[11]。

如圖5所示，與對照組相比，模型組GO功能富集程度最高的分別為陰離子跨膜轉運、突觸前、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。與模型組相比，黃芪-丹參藥對組GO功能富集程度最高的分別為Ras蛋白信號轉導、囊泡膜、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。

KEGG分析結果如圖6所示，與對照組相比，模型組差異表達miRNA靶基因主要富集在哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、自噬、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路、FoxO信號通路、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路等途徑。與模型組相比，黃芪-丹參藥對組差異表達miRNA靶基因主要富集在MAPK信號通路、mTOR信號通路、自噬、AMPK信號通路、TGF-β信號通路、Ras信號通路等途徑。

3.6 差異表達miRNA與靶基因網絡的構建

構建各組間差異表達miRNA和其靶基因的局部網絡圖見圖7，以確定2種類型基因間的功能性相互作用，為進一步闡明黃芪-丹參藥對改善高血壓腎損害的作用機制提供依據。

圖2 模型組與對照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對組與模型組比較 (B) 腎組織差異表達miRNA的熱圖Fig.2 Heat map of differential expression miRNA of kidney tissue in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

圖3 模型組與對照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對組與模型組比較 (B) 腎組織差異表達miRNA的火山圖Fig.3 Volcano map of differential expression miRNA of kidney tissue in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

表3 各組大鼠腎組織差異表達miRNATable 3 Analysis of differentially expressed miRNA in kidney of rats in each group

圖4 模型組與對照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對組與模型組比較 (B) 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證Fig.4 qRT-PCR verification of differentially expressed miRNA in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

圖5 模型組與對照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對組與模型組比較 (B) 差異表達miRNA靶基因的GO功能富集分析 (前10)Fig.5 GO function enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B) (top 10)

圖6 模型組與對照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對組與模型組比較 (B) 差異表達miRNA靶基因的KEGG通路富集分析 (前30)Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B) (top 30)

圖7 模型組與對照組比較 (A)、黃芪-丹參藥對組與模型組比較 (B) 差異表達miRNA與靶基因的網絡圖Fig.7 Network diagram of differentially expressed miRNA and target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

4 討論

持續穩定的高血壓可誘發腎臟血流動力學改變，直接造成腎臟的組織病理變化，使腎小動脈管壁增厚、管腔狹窄，引發腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質纖維化，進而影響腎功能，因此，血壓控制的穩定在一定程度上影響患者進入ESRD的時間和速度，早期發現并診斷對高血壓腎損害患者的治療和預后起至關重要的作用。腎活檢雖是診斷疾病的金標準，但不常作為觀察高血壓腎損害患者病情動態變化的直接方法，尋找非創性生物標志物是高血壓腎損害等腎臟疾病的研究目標。

miRNA作為關鍵上游基因，在促進或抑制高血壓腎損害的發生發展中發揮重要作用。本研究miRNA高通量測序結果顯示，模型組與對照組的miRNA表達譜存在差異，在篩選出的115個差異表達miRNA中，68個表達上調、47個表達下調，其中與對照組比較，模型組miRNA-142-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-3585-5p表達在miRNA測序和qRT-PCR驗證中均上調。miRNA-142-5p可通過靶向調控信號淋巴細胞活化分子相關蛋白（SLAM-associated protein，SAP）、CD84抑制T細胞過度活化，間接影響B細胞的抗體生成，其表達水平與狼瘡性腎炎的活動性密切相關[12]。在氧化低密度脂蛋白的刺激下，高表達的miRNA-142還可促進高脂血癥及動脈粥樣硬化的發展進程[13]。miRNA-219-5p被證實可以靶向結合E-鈣黏蛋白并下調其表達水平，誘導上皮間質轉化（epithelial mesenchymal trasition，EMT），進而影響器官纖維化的發生[14]。目前尚缺乏關于miRNA-3585-5p的詳盡報道。本研究發現，經黃芪-丹參藥對干預后，模型組大鼠上述3個基因表達水平均顯著下調，提示miRNA-142-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-3585-5p可能是黃芪-丹參藥對延緩高血壓腎損害進程的直接靶點。

利用GO的結構功能體系，把參與同樣功能或通路的基因進行分類，對研究高血壓腎損害的發生發展機制有重要意義。本研究GO功能富集分析發現，與高血壓腎損害相關的GO條目集中在陰離子跨膜轉運、L-氨基酸轉運、細胞生長、缺氧應答、囊泡膜、細胞質囊泡膜、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、L-氨基酸跨膜轉運蛋白活性、小三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶結合等方面，提示由于高血壓引起機體內環境的紊亂，使細胞質、囊泡膜等成分變化，影響機體缺氧應答、離子轉運、細胞內信號轉導及電解質平衡，致使機體能量代謝異常。KEGG通路分析顯示，模型組差異表達miRNA的靶基因主要富集于mTOR、MAPK、自噬、AMPK及TGF-β信號通路等。mTOR是一種進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其信號通路的激活可調節腎臟細胞內的自噬水平、氧化應激及炎性反應，使腎臟細胞外基質（extracellular matrix，ECM）生成增加，促進腎臟纖維化[15]；此外，mTOR通路還參與氨基酸、葡萄糖及脂質的代謝。MAPK通路是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的重要信號轉導系統，在慢性腎衰竭模型大鼠中，MAPK信號通路被激活，p38 MAPK、胞外信號調控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、c-Jun-N-末端激酶（c-Jun-N-terminal kinase，JNK）蛋白的磷酸化水平升高，促進腎小管上皮EMT，加重腎纖維化的程度[16]。AMPK通路是細胞內能量的開關，高血壓狀態下局部腎組織的缺血缺氧可使AMPK通路激活，進而調控細胞內的能量、糖、脂及蛋白質代謝；AMPK通路可抑制mTOR通路，增強細胞自噬，參與高血壓腎損害病理進程的調控[10]。TGF-β是公認的促腎纖維化細胞因子，可直接增強腎小管上皮EMT，引起ECM異常堆積，使腎小球基底膜增厚，促進腎臟纖維化[17-18]。綜合黃芪-丹參藥對組差異表達miRNA靶基因的KEGG通路富集分析結果，推測黃芪-丹參藥對可能通過調節篩選出的差異表達miRNA，調控相關信號通路，從而發揮延緩高血壓腎損害進程的作用。

近年來，隨著精準醫療和大數據時代的蓬勃發展以及基因芯片、高通量測序等生物技術的廣泛應用，與多種疾病發生、發展、診治及預后相關的特定miRNA日益被發掘并予以鑒定，從而為闡明疾病的作用機制和調控網絡提供新思路。本研究通過分別對對照組、模型組及黃芪-丹參藥對組大鼠腎組織進行miRNA測序，構建各組間差異miRNA的表達譜，并預測相應的靶基因；應用生物信息學技術系統分析，篩選與黃芪-丹參藥對干預高血壓腎損害密切相關的miRNA靶點及調控通路，為高血壓腎損害的機制研究和防治提供依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突