基于糞便代謝組學的黃芩酒炙改善急性肺損傷的作用機制研究

孫豪杰，王雅琪，胡婷婷，萬 娜，袁 恩，伍振峰，楊 明

江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效[1]。《中國藥典》2020年版收載黃芩和酒黃芩2個品種：生黃芩清熱瀉火，解毒力強，常須炮制后使用；酒黃芩可借酒升騰之力，用于治療上焦肺熱及四肢肌表之濕熱[2]。本課題組前期對黃芩炮制前后的化學成分進行分析，發現黃芩酒炙后，黃酮苷類成分含量下降，黃酮苷元含量上升，苷類成分與苷元的比例變化趨勢明顯，可作為區分黃芩炮制前后的化學標志物[3-6]，表明酒炙后黃芩藥材發生化學成分等內在變化，影響藥物的性質及作用方向。目前針對黃芩酒炙對內源性成分、代謝通路等調控作用的研究較少，開展關于黃芩酒炙升提清肺熱的機制研究對闡述酒炙內涵具有重要意義。

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種肺內（肺炎、感染等）或肺外致病因素導致的急性彌漫性炎性肺損傷，進而引起急性呼吸衰竭的臨床綜合征[7-8]。全球急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的病死率高達40%以上，為威脅人類健康的重要疾病。本研究對生、酒黃芩治療脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI小鼠的藥效作用差異及其糞便中差異性內源性代謝物進行研究，闡明生、酒黃芩抑制肺部炎性反應潛在的生物標志物及相關代謝通路，為酒炙黃芩“行上焦、清濕熱”的作用機制研究提供依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量（20±2）g，購自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（魯）20160001。動物于相對濕度（50±10）%、溫度（20±2）℃、自然節律光照的SPF級動物房適應性飼養1周，自由進食飲水。動物實驗經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號JZSYDWLL-20200611）。

1.2 藥品與試劑

生黃芩飲片（批號18062101）購自天津盛實百草藥業有限公司，經江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室楊明教授鑒定為唇形科植物黃芩S.baicalensisGeorgi的干燥根，酒黃芩飲片由生黃芩按《中國藥典》標準規范炮制而成；LPS（批號MB5198）購自美國Sigma公司；地塞米松磷酸鈉注射液（批號1901082）購自湖北天藥藥業有限公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號2020-06R）購自江蘇酶免實業有限公司；質譜級甲醇、乙腈購自上海羅恩公司；色譜級甲酸購自德國Merck公司。

1.3 儀器

Triple TOFTM5600型液相色譜-串聯質譜儀（LC-MS，美國AB SCIEX公司）；Multiskan GO 1510型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA124型萬分之一電子分析天平、BT25S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；TGL-20MC型臺式高速冷凍離心機（湖南湘鑫儀器儀表有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；V3S025型漩渦儀（德國IKA公司）；Medium-E400UF型實驗室純水系統（上海和泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 生、酒黃芩提取物的制備

稱取生黃芩50 g，分別加入10、8倍量的水回流提取2 h，經紗布濾過，合并2次濾液，旋轉蒸發濃縮至50 mL，得到含生藥量1 g/mL的生黃芩提取物。酒黃芩按同法制得酒黃芩提取物。

2.2 分組、給藥與造模

C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松（5 mg/kg）組、生黃芩（15 g/kg）組和酒黃芩（15 g/kg）組，每組8只。生黃芩組和酒黃芩組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續7 d；地塞米松組第1～6天ig等體積蒸餾水，第7天ip地塞米松磷酸鈉注射液。末次給藥30 min后，小鼠吸入異氟烷麻醉，模型組和各給藥組小鼠口咽后壁滴入50 μL LPS溶液（1 mg/mL），對照組滴入生理鹽水，迅速捏住小鼠鼻孔，維持30 s，等待出現輕微氣管羅音，即造模成功。造模16 h后，于無菌條件下手持小鼠，擠壓小鼠肛門刺激排便，用無菌凍存管收集，于液氮中保存。

2.3 生、酒黃芩對ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影響

小鼠吸入CO2安樂死，行頸部手術暴露氣管，在甲狀腺位置做T型切口，用22 G靜脈穿刺針做氣管插管，以0.5 mL PBS溶液灌洗左肺3次，回抽灌洗液即得BALF，1500 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平。

2.4 生、酒黃芩對ALI小鼠肺干濕質量比和臟器指數的影響

取小鼠右肺下葉，稱定質量，計算肺干濕質量比；取胸腺、脾臟，稱定質量，計算小鼠臟器指數。

肺干濕質量比＝肺干質量/肺濕質量

臟器指數＝臟器質量/小鼠體質量

2.5 生、酒黃芩對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

取小鼠右肺上葉浸泡于組織固定液中，室溫放置24 h以上，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 糞便代謝組學研究

2.6.1 糞便樣本處理 稱取各組小鼠糞便樣本20 mg，加入120 μL甲醇，勻漿1 min，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL，進行超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOF-MS）分析。稱取各糞便樣本10 mg，按上述方法處理后作為質控樣品。分析前連續進樣3次確保儀器穩定性良好，分析過程中每進8針樣品后進1針質控樣品。

2.6.2 色譜條件 Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），流動相為甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，5%～25% B；4～10 min，25%～45% B；10～22 min，45%～95% B；22～25 min，95%～5% B；體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣體積為1 μL。

2.6.3 質譜條件 離子化模式為電噴霧正離子模式和負離子模式；離子源電壓為5500 V；離子源溫度為550 ℃；去簇電壓為100 V/-100 V；碰撞能量為35 eV/-35 eV，碰撞能量擴展為20 eV；霧化氣體為N2；輔助氣1為379.225 kPa，輔助氣2為379.225 kPa，氣簾氣為241.325 kPa；一級質譜母離子掃描范圍為m/z50～1250；IDA設置響應值超過10 cp的峰優先進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為m/z50～1250，開啟動態背景扣除。

2.7 數據處理及分析

使用Markview 1.3.1軟件對原始數據進行峰識別、對齊、濾噪、峰面積歸一化等預處理，得到含有代謝物保留時間（tR）、質荷比、強度等信息的數據矩陣文件。將其導入SIMCA-P 14.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），將變量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）＞1.0和P＜0.05的變量視為差異變量。

利用HMDB（http://www.hmdb.ca/）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫（http://www.kegg.ca/）對差異變量的二級碎片離子進行鑒定，檢索誤差范圍設置為0.1；使用MetaboAnalyst 5.0數據庫（http://www.metaboanalyst.ca/）進行代謝通路分析，影響值＞0.1的代謝通路被認為是潛在的靶點路徑。

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析數據，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。數據以±s表示，采用GraphPad Prism 8軟件繪制統計圖。

3 結果

3.1 生、酒黃芩對ALI小鼠BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著升高（P＜0.01），IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，生、酒黃芩組小鼠BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著降低（P＜0.01），IL-10水平顯著升高（P＜0.01）；酒黃芩抑制ALI小鼠肺部炎性反應作用明顯優于生黃芩（P＜0.01）。

3.2 生、酒黃芩對ALI小鼠肺干濕質量比和臟器指數的影響

胸腺和脾臟指數通常被用作評估宿主免疫能力。如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠胸腺和脾臟指數均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，酒黃芩組小鼠胸腺指數和脾臟指數均顯著升高（P＜0.05、0.01），生黃芩組小鼠胸腺指數和脾臟指數呈升高趨勢，地塞米松組小鼠胸腺指數和脾臟指數均顯著降低（P＜0.01），表明地塞米松對機體免疫器官造成損傷[9]。肺水腫是ALI最主要的病理特征之一，與對照組比較，模型組小鼠肺干濕質量比顯著升高（P＜0.01），肺水腫嚴重；與模型組比較，地塞米松組和酒黃芩組小鼠肺干濕質量比顯著降低（P＜0.01），生黃芩組小鼠肺干濕質量比呈降低趨勢，表明酒黃芩改善ALI小鼠臟器損傷的作用優于生黃芩。

圖1 生、酒黃芩對ALI小鼠BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影響 ( ±s,n=8)Fig.1 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on levels of IL-6,IL-8,IL-10 and TNF-α in BALF of ALI mice ( ±s,n=8)

圖2 生、酒黃芩對ALI小鼠胸腺指數、脾臟指數和肺干濕質量比的影響 ( ±s,n=8)Fig.2 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on thymus index,spleen index and lung dry-wet weight ratio in ALI mice ( ±s,n=8)

3.3 生、酒黃芩對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組小鼠肺組織結構清晰，肺泡間隔及肺泡腔未見明顯病理改變；模型組小鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯，肺泡壁明顯增厚和間質水腫，表明造模成功；各給藥組肺組織病變程度降低，炎性細胞浸潤和紅細胞滲出、增生等情況均有所改善，其中酒黃芩組與對照組小鼠肺組織形態相似。

3.4 UPLC-QTOF-MS分析

正、負離子模式下，小鼠糞便總離子流圖見圖4。針對系統穩定性，隨機選取質控樣本中的12個分子離子峰，計算其tR和峰強度的RSD見表1，選取的12個分子離子峰tR的RSD為0.02%～0.15%，峰強度的RSD為3.14%～8.78%，表明質控樣品中的離子具有良好的質量準確度，符合代謝組學分析要求。

3.5 多元統計分析

3.5.1 PCA分析 如圖5所示，正、負離子模式下，各組樣本之間存在一定的交叉，但對照組與模型組樣本可較明顯地分開，表明ALI小鼠糞便中的代謝物發生了明顯的變化。

圖3 生、酒黃芩對ALI小鼠肺組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.3 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on pathological changes of lung tissues in ALI mice (HE,× 100)

圖4 正離子 (A)、負離子 (B) 模式下的小鼠糞便總離子流圖Fig.4 Total ion chromatograms in fecal samples obtained in positive mode (A) and negative mode (B)

3.5.2 OPLS-DA分析 采用有監督的OPLS-DA方法確定ALI小鼠造模前后及生、酒黃芩治療后糞便中內源性差異代謝物，如圖6所示，對照組和模型組樣本區分明顯，正離子模式：R2X=0.451，R2Y=0.994，Q2=0.869；負離子模式：R2X=0.766，R2Y=1.000，Q2=0.814，表明該模型具有較好的魯棒性和預測能力。

表1 系統穩定性驗證Table 1 System stability investigation

圖5 正離子 (A)、負離子 (B) 模式下各組小鼠糞便樣品的PCA得分圖Fig.5 PCA score plots of fecal samples of mice in different groups in positive mode (A) and negative mode (B)

3.6 ALI小鼠糞便差異代謝物分析

基于上述OPLS-DA模型，結合VIP＞1且P＜0.05的篩選條件及數據庫匹配結果，最終在對照組與模型組小鼠糞便中鑒定出10個差異代謝物（表2）。與對照組比較，模型組小鼠糞便中L-蛋氨酸、孕酮、孕烯醇酮、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸和鞘氨醇水平顯著升高，花生四烯酸、L-色氨酸、2′-脫氧尿苷和鳥苷水平顯著降低。

影響ALI的代謝通路見圖7，其中影響值＞0.1的代謝通路有9條，分別為：①苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸的生物合成；②D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝；③苯丙氨酸代謝；④花生四烯酸代謝；⑤丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；⑥鞘脂類代謝；⑦色氨酸代謝；⑧精氨酸的生物合成；⑨半胱氨酸和蛋氨酸代謝。由此可見，ALI小鼠體內正常的氨基酸代謝與脂質代謝水平發生紊亂。

圖6 正、負離子模式下小鼠糞便樣品OPLS-DA得分圖 (A、B) 及相應模型驗證圖 (C、D)Fig.6 OPLS-DA score plots (A,B) and corresponding model validation plot (C,D) of fecal samples in mice in positive and negative modes

表2 ALI小鼠糞便內源性差異代謝物Table 2 Different endogenous metabolites in fecal samples of ALI mice

圖7 ALI小鼠糞便代謝通路圖Fig.7 Fecal metabolic pathways analysis in ALI mice

3.7 生、酒黃芩對ALI小鼠糞便中差異代謝物的影響

如圖8所示，與模型組比較，生黃芩組小鼠糞便代謝物花生四烯酸、2′-脫氧尿苷、鳥苷和L-色氨酸水平顯著升高（P＜0.01），L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、孕酮、孕烯醇酮和鞘氨醇水平顯著降低（P＜0.01）；酒黃芩組小鼠糞便代謝物花生四烯酸、鳥苷和L-色氨酸水平顯著升高（P＜0.05、0.01），L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、孕酮、孕烯醇酮和鞘氨醇水平顯著降低（P＜0.01）；生、酒黃芩組L-蛋氨酸水平無明顯變化。

圖8 生、酒黃芩對ALI小鼠糞便中差異代謝物的影響 ( ±s,n=8)Fig.8 Effect of raw and wine-processed Scutellariae Radix on differential metabolites in feces of ALI mice ( ±s,n=8)

表3 生、酒黃芩干預ALI小鼠糞便內源性差異代謝物Table 3 Different endogenous metabolites in feces of ALI mice intervened by raw and wine-processed Scutellariae Radix

圖9 生、酒黃芩干預后ALI小鼠糞便代謝通路圖Fig.9 Fecal metabolism pathway in ALI mice intervened by raw and wine-processed Scutellariae Radix

圖10 不同組間的糞便差異代謝物韋恩圖Fig.10 Venn diagram of differential metabolites in feces between different groups

生、酒黃芩干預ALI的糞便差異代謝物見表3，代謝通路見圖9，生、酒黃芩通過調節不同代謝途徑發揮作用。各組間小鼠糞便差異代謝物韋恩圖見圖10，對照組與模型組、模型組與生黃芩組重疊的差異代謝物為鞘氨醇和L-谷氨酸；對照組與模型組、模型組與酒黃芩組重疊的差異代謝物為L-苯丙氨酸。生黃芩通過D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝通路以及鞘脂類代謝通路緩解ALI，而酒黃芩則調節苯丙氨酸代謝通路發揮療效。

4 討論

本研究通過小鼠口咽吸入LPS建立ALI模型，發現模型組小鼠出現免疫臟器損傷以及嚴重的肺組織損傷，且體內炎性因子水平失衡；酒黃芩的療效優于生黃芩，與炮制理論一致。采用糞便代謝組學探究ALI潛在發病機制及黃芩酒炙干預ALI的內在機制，發現與對照組相比，ALI小鼠糞便中鑒定得到10個差異代謝物，主要包括氨基酸類、鞘氨醇及花生四烯酸等，主要涉及多種氨基酸的合成與代謝以及脂質代謝，這些潛在的代謝通路與文獻報道一致[10]。生黃芩組中鑒定得到24個差異代謝物，酒黃芩組中鑒定得到21個差異代謝物，結合通路富集分析和組間差異代謝物的并集分析，發現生黃芩通過調節D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝通路和鞘脂類代謝通路發揮作用，而酒黃芩通過苯丙氨酸代謝通路發揮作用。

D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝通路中主要的代謝物L-谷氨酸和L-谷氨酰胺在抗氧化中發揮著重要作用[11-12]。活性氧自由基的過量產生可引起ALI[13]，因此當與抗氧化劑相關的代謝通路激活時，生成抗氧化劑清除過量氧自由基，恢復免疫系統的正常運行，維持機體氧化還原平衡。谷氨酸受體重要亞型之一的N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D- aspartate，NMDA）受體可因肺內谷氨酸含量升高而過度激活，使肺組織出現高通透性肺水腫[14]。本研究檢測到模型組小鼠糞便中谷氨酸水平顯著升高，表明LPS刺激后谷氨酸釋放增多；在生黃芩干預下，谷氨酸水平顯著下調，提示生黃芩可能通過阻斷谷氨酸NMDA受體，發揮維持谷氨酸穩態與抗氧化應激的作用。近年來，大量研究表明苯丙氨酸在急性炎性疾病中發揮作用。體內高濃度苯丙氨酸可能增加ARDS的死亡率[15]。嚴重的肺部炎性反應導致苯丙氨酸-4-羥化酶及5,6,7,8-四氫生物蝶呤活性降低，苯丙氨酸累積，從而促進炎性反應[16]。本研究發現，給予酒黃芩后，ALI小鼠糞便中苯丙氨酸向正常水平回調，提示酒黃芩具有促進其轉化并抑制炎性反應的作用。

綜上，本研究通過ALI模型模擬上焦濕熱癥，考察生、酒黃芩干預ALI小鼠的藥效差異以及內源性代謝物的差異影響，探討黃芩酒炙“行上焦、清濕熱”的作用機制，為解釋中藥炮制機制提供了一種新模式。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突