基于特征圖譜和網絡藥理學的經典名方黃連湯質量標志物（Q-Marker）預測分析

彭梅梅，郭 爽，陳 琪，王 夢，徐 禎，錢怡潔，毛 靖，許金國，季 德，陸兔林*，毛春芹*

1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023

2.南京中醫藥大學附屬醫院江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029

黃連湯（Huanglian Decotion，HLD）出自東漢張仲景《傷寒論》，收錄于《古代經典名方目錄（第一批）》，全方由黃連、甘草（炙）、干姜、桂枝（去皮）、人參、半夏（洗）、大棗（擘）7味藥組成，主治傷寒胸中有熱、胃中有邪氣、腹中痛、欲嘔吐者[1]。黃連湯具有明顯的特色與優勢，目前仍廣泛應用，現代臨床研究表明黃連湯及其加減方常用于治療胃腸疾病及其他疾病等[2-3]。質量標志物（quality marker，Q-Marker）這一概念最早于2016年由劉昌孝院士[4]提出，旨在解決中藥質量控制指標與中藥的有效性關聯度低、質量控制指標專屬性差等阻礙中藥質量研究與行業發展的共性問題[5]。

本研究建立黃連湯基準樣品特征圖譜，對共有峰進行歸屬分析，明確“飲片-基準樣品”的內在關聯，以期形成穩定可行的物質基準質量標準；并結合網絡藥理學技術構建“成分-靶點-通路”網絡，預測分析黃連湯發揮臨床療效的潛在Q-Marker，為全面控制和評價黃連湯的質量提供方法依據，并為研究黃連湯治療疾病的藥效作用機制提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配備四元泵、柱溫箱、自動進樣器，2998檢測器、Empower 3色譜工作站，美國Waters公司；FA1104型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司，d＝0.1 mg；MS105DU型電子分析天平，梅特勒-托利多公司，d＝0.01 mg；Milli-Q Intergral水純化系統，美國Millipore公司；KQ-500E數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；砂鍋，江西舒雅陶瓷有限公司；電陶爐，中山市愛米生活電器有限公司。

1.2 試藥

對照品鹽酸小檗堿（批號110713-201814，質量分數86.7%）、鹽酸巴馬汀（批號110732-201611，質量分數86.8%）、鹽酸黃連堿（批號112026- 201601，質量分數95.1%）、甘草苷（批號111610- 201607，質量分數93.1%）、甘草酸銨（批號110731- 201720，質量分數97.7%）、6-姜辣素（批號111833- 201806，質量分數99.9%）、桂皮醛（批號110710- 201217，質量分數99.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

磷酸二氫鉀、磷酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈，色譜純，默克股份有限公司；甲醇，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；其他試劑均為分析純。

黃連湯原料藥材購自道地產區或主產區，每個藥材不少于3個產地，總批次不少于15批；藥材基原、藥用部位、產地、采收加工均明確，均經過南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定。經研究，除黑龍江及吉林通化人參藥材批次不符合規定外，其余藥材各產地質量均符合《中國藥典》2020年版一部規定，藥材來源批號見表1。按照《中國藥典》2020年版及全國炮制規范將藥材炮制成對應飲片，飲片經檢測均符合《中國藥典》2020年版各飲片規定標準。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

按處方量分別稱取黃連41.40 g，甘草（水炙）41.40 g，干姜41.40 g，桂枝41.40 g，人參27.60 g，半夏（湯洗）60.00 g，大棗42.00 g于砂鍋中，加2000 mL水，浸泡60 min，以武火（2200 W）煮沸后，調節火力至文火（900 W）保持微沸，煎煮約60 min后，趁熱濾過，濾液放涼后加水調整體積至1200 mL[1]。

表1 黃連湯藥材來源信息Table 1 Source information of Huanglian Decoction

精密量取上述液體2 mL至10 mL量瓶中，加入甲醇7 mL，加水至刻度，使甲醇濃度為70%，稱定質量，超聲30 min，放冷，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加入甲醇配制成分別含鹽酸小檗堿217.28 μg/mL、鹽酸黃連堿113.96 μg/mL、鹽酸巴馬汀103.18 μg/mL、甘草苷104.30 μg/mL、甘草酸單銨鹽173.60 μg/mL、桂皮醛34.30 μg/mL、6-姜辣素62.72 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Merck Purospher Star LP RP-18endcapped柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（含0.05 mol/L磷酸二氫鉀，磷酸調節pH值為3.0）；梯度洗脫：0～7 min，10%～22%乙腈；7～19 min，22%～23.5%乙腈；19～28 min，23.5%～24%乙腈；28～42 min，24%～35%乙腈；42～52 min，35%～63%乙腈；52～54 min，63%～10%乙腈；54～56 min，10%乙腈；體積流量1 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；進樣體積10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，連續進樣6次。以穩定性好，分離度高的小檗堿（12號峰）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD，結果各共有峰相對保留時間RSD＜0.39%，相對峰面積RSD＜2.46%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一份黃連湯基準樣品，按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定。以小檗堿為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果各共有峰相對保留時間RSD＜0.65%，相對峰面積RSD＜2.73%，表明方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h進樣。以小檗堿為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD，結果各共有峰相對保留時間RSD＜0.73%，相對峰面積RSD＜2.44%，表明樣品24 h內穩定性良好。

2.5 基準樣品特征圖譜建立及相似度評價

利用Excel中RANDBETWEEN函數生成隨機數，將黃連、甘草（水炙）、干姜、桂枝、人參、大棗、半夏（湯洗）7味飲片的不同批次隨機組合，按照“2.1”項下方法制備18批黃連湯基準樣品（HLD1～HLD18）供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，將色譜圖依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A）軟件，以HLD1號樣品的特征圖譜作為參照圖譜，采用中位數法，進行多點校正和色譜峰匹配，得到18批樣品疊加圖及共有模式圖，見圖1、2，確定了17個共有峰，經與化學對照品的色譜行為進行比較，鑒定出7個色譜峰，分別為5號峰甘草苷，10號峰黃連堿，11號峰巴馬汀，12號峰小檗堿，14號峰桂皮醛，15號峰甘草酸，17號峰6-姜辣素。與對照特征圖譜相比為參照圖譜，設其相似度為1.000，計算18批黃連湯基準樣品的相似度，結果HLD1～HLD18的相似度分別為0.997、0.997、0.998、0.998、0.999、0.997、0.998、0.998、0.996、0.997、0.998、0.996、0.997、0.999、0.996、0.995、0.997、0.994，可見各批次樣品特征圖譜相似度均大于0.95，基準樣品特征圖譜相似度良好，表明基準樣品的穩定性較好，主要物質群差異性小，形成的基準樣品對照圖譜能夠作為衡量黃連湯制劑的標準參照物。

2.6 基準樣品共有峰的歸屬研究

按供試品制備方法，分別制備單味飲片供試品溶液、各陰性供試品溶液及黃連湯基準樣品供試品溶液，照“2.3”項下特征圖譜條件進樣檢測，分別將7味飲片單味飲片供試品溶液、陰性供試品溶液和基準樣品供試品溶液色譜圖進行比對，結果見圖3。可見黃連湯基準樣品特征圖譜中共有10個峰來自黃連，3個峰來自甘草（水炙），1個峰來自干姜，3個峰來自桂枝，半夏（湯洗）、大棗、人參在此條件下沒有色譜信息。對黃連湯基準樣品各共有峰進行歸屬分析，共歸屬17個共有峰，經對照品指認7個色譜峰信息，指認率為41.2%，結果見表2。其中1～3、6～9、10（黃連堿）、11（巴馬汀）、12（小檗堿）號峰來源于黃連；4、5（甘草苷）、15（甘草酸）號峰來源于甘草；13、14（桂皮醛）、16號峰來源于桂枝；17號峰（6-姜辣素）來源于干姜；人參、半夏、大棗在此色譜條件下沒有色譜信息，后續將進行進一步深入研究。

圖1 18批黃連湯基準樣品 HPLC特征圖譜疊加圖Fig.1 Overlay of characteristic spectrums of 18 batches of HLD reference samples

圖2 黃連湯基準樣品對照特征圖譜 (A) 和混合對照品 (B) 圖Fig.2 Characteristic spectrum of material reference of HLD (A) and mixed reference substances (B)

圖3 黃連湯基準樣品色譜峰歸屬Fig.3 Attribution of chromatographic peaks of HLD reference samples

表2 黃連湯基準樣品共有峰歸屬情況Table 2 Attribution of common peaks of HLD reference samples

各味藥材飲片特征圖譜中主要物質群可以從飲片-基準樣品較為完整地傳遞，且物質群的歸屬關系清晰，說明黃連湯基準樣品的物質群可清晰的追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認率較高。

2.7 基于網絡藥理學的黃連湯功效關聯物質預測分析

2.7.1 基于可測性及可溯性的活性成分篩選 根據文獻研究，黃連為黃連湯君藥，其主要活性成分為生物堿類成分[6]，包含小檗堿、巴馬汀、黃連堿、非洲防己堿等，具有抗菌、降糖調脂、抗腫瘤、抗胃潰瘍等藥理作用[7-8]；甘草的主要活性成分為三萜類和黃酮類，甘草苷有清熱解毒的功效，甘草酸有抗炎鎮咳、免疫調節的作用[9]；干姜的主要有效成分為姜辣素類，具有止嘔等藥理作用[10]；桂枝的主要有效成分為揮發油類，具有抗菌抗炎、抗病毒等藥理作用[11]；人參的主要有效成分為多糖類、皂苷類，具有強心抗休克、抗心肌缺血等藥理作用[12]；半夏主要有效成分為生物堿類及有機酸類；大棗的有效成分為多糖類。

藥典標準項下對于組方藥的控制主要為黃連的黃連堿、巴馬汀、小檗堿、表小檗堿，甘草的甘草苷及甘草酸，干姜的6-姜辣素，桂枝的桂皮醛，人參的人參皂苷Rg1、Re、Rb1。基于文獻研究結合指紋圖譜及特征圖譜的可測性及可溯性，確定特征圖譜所指認的黃連堿、巴馬汀、小檗堿、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素、桂皮醛7個活性成分為候選化合物。通過Pubchem Compound化合物數據庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取7個候選化合物的Canonical SMILES編號，為后續黃連湯“成分-靶點-通路”網絡的構建做準備。

2.7.2 黃連湯活性靶點預測 將7個成分的Canonical SMILES輸入swiss target prediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，并結合中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），獲得7個化合物共涉及286個作用靶點蛋白，為相關通路的預測做準備。

將篩選出的286個靶點，導入在線STRING 11.0分析數據庫（https://string-db.org），選擇物種為“Homo sapiens”，選取最高置信度蛋白交互參數評分值＞0.9的蛋白互作數據，篩選到229個靶點，將結果以TSV文本格式導入Cytoscape 3.8.1軟件，并利用Cytoscape 3.8.1軟件中的“Network Analyzer”功能對蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡進行拓撲屬性分析，計算選取介數中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）和度值（degree）3個重要拓撲參數均大于中位數且度值≥16的靶點作為核心靶點，經篩選得到30個核心靶點，結果見圖4，圖中節點大小與度值成正比關系。其中度值最高的磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol 3′-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）能與57個蛋白發生相互作用。

2.7.3 黃連湯活性成分富集分析 利用R軟件對黃連湯的30個核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。背景數據庫和基因集限定物種為“Homo sapiens”，閾值設置為P＜0.05。前20條GO分析結果如圖5所示，主要涉及聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合（RNA polymerase II-specific DNA- binding transcription factor binding）、DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/ threonine kinase activity）等過程。KEGG分析共得到139條具有顯著意義的通路，前20條與黃連湯相關度較高的通路如圖6所示，主要包括炎癥、感染、癌癥等。

圖4 PPI網絡Fig.4 PPI network

圖5 GO富集分析的生物過程條目氣泡圖Fig.5 Entry bubble diagram of biological process by GO enrichment analysis

圖6 核心靶點的KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of core targets

圖7 “成分-靶點-通路”網絡Fig.7 “Component-target-pathway” network

2.7.4 “成分-靶點-通路”網絡構建及分析 將篩選到的黃連湯中的7個活性成分、30個核心靶點、排名前20條信號通路運用Cytoscape 3.8.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡，見圖7。由網絡圖可以看 出，黃連湯中7個活性成分通過作用于多靶點在不同的信號通路中發揮作用，且成分、靶點、通路間存在錯綜復雜的關系，黃連中的黃連堿、巴馬汀、小檗堿具有抗炎、抑菌功效，促使萎縮胃黏膜修復；桂枝中的桂皮醛及干姜中的萜類化合物抗氧化活性明顯能促使胃黏膜損傷程度減輕；干姜醇提取物、甘草中的甘草苷和甘草酸、半夏水煎醇沉液均可經不同機制對胃黏膜幽門螺旋桿菌感染進行抑制，具有良好的抗潰瘍作用；大棗多糖能促使胃腸道功能得到改善；顯示了中藥復方治療疾病作用機制的復雜性。

2.7.5 Q-Marker的分析 黃連湯主治上熱下寒諸癥，現代臨床主要治療胃腸道疾病。現代研究發現黃連湯可通過抗炎、調節胃腸蠕動和調節腸道微生態等多個方面改善胃腸道疾病，臨床療效顯著[13]。GO分析結果顯示，黃連湯對蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性以及G蛋白偶聯受體結合等途徑具有廣泛調節作用。KEGG分析結果表明，黃連湯主要對感染、炎癥及癌癥等相關信號通路起調節作用。研究發現，原癌基因肉瘤基因（sarcoma gene，SRC）表達活性增強及PIK3CA突變可能導致結腸癌，SRC能激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（research of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）等多條信號通路，其中信號轉導蛋白和轉錄激活物（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）可通過介導炎癥，介質的細胞外信號調控腫瘤細胞、免疫細胞等生物學行為，促進腫瘤發生及相關炎癥的形成[14]，PI3K/Akt信號通路通過對自噬產生負調控作用，促進腫瘤細胞的生長、增殖和存活[15]。另有研究表明，糖脂代謝紊亂利于幽門螺旋桿菌感染和繁殖[16]，且可通過引起神經病變和微循環障礙導致胃蠕動障礙和胃黏膜萎縮[17]，其通過調節AGE-RAGE信號通路、耶爾森菌感染、巨噬細胞病毒感染等通路抑制病毒感染與繁殖。趨化因子與相關受體結合吸引白細胞移行到感染部位，在炎癥反應中具有重要作用，已有研究證實趨化因子10和28，趨化因子受體4和6在慢性胃炎的胃黏膜組織中均高表達，另有研究表明T細胞受體信號通路在識別特異性抗原、激活T細胞、確保調節性T細胞功能方面具有重要作用。此外，腫瘤的發生與發展與炎癥微環境密切相關，慢性炎癥可能是介導腫瘤侵襲和轉移的關鍵節點[18]，白細胞介素 2（interlenkin-2，IL-2）作為銜接炎癥與腫瘤的炎癥因子，與實質受體結合為酪氨酸磷酸激酶，從而啟動細胞內蛋白激酶介導的磷酸化級聯反應，最終導致STAT3磷酸化水平上調。

綜上所述，黃連湯通過7味藥間不同活性成分的協同作用，可能從以下方面發揮治療胃腸道疾病作用：下調SRC蛋白表達水平，抑制結腸癌細胞增殖；調節IL-2炎癥因子表達，抑制細胞內蛋白激酶介導的磷酸化級聯反應；下調STAT3磷酸化水平，抑制腫瘤相關炎癥形成；抑制PI3K/Akt信號通路活化，促進細胞自噬與細胞凋亡，降低促炎癥因子IL2釋放。基于網絡藥理學預測結果與已有文獻結果較為接近，表明該方法具有一定的準確性，同時契合中藥整體觀、系統性的理念，為進一步闡明黃連湯物質基礎及治療胃腸道疾病機制提供了參考。

由此可見，黃連湯中關鍵效應成分可作用于多靶點，干預多個通路達到與臨床治療胃腸道疾病一致的療效，進一步表明特征圖譜所選指標成分的合理性。網絡藥理學從理論上證明了其有效性，結合前文及特征圖譜和網絡藥理學對黃連湯中的Q-Marker進行預測分析，黃連堿、巴馬汀、小檗堿、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、6-姜辣素這7個成分基本符合Q-Marker的五原則，故預測其為黃連湯潛在的Q-Marker。

3 討論

中藥和復方制劑成分復雜，本研究以特征圖譜為指標，考察飲片-基準樣品的相關性及傳遞性。特征圖譜結果顯示主要物質群可以從飲片-基準樣品逐級較為完整地傳遞，且歸屬關系清晰。從色譜峰個數和峰強度進行分析，黃連、桂枝與甘草對特征圖譜的貢獻最大；其次為干姜，其主要成分為揮發油，在本特征圖譜條件下可檢出1個色譜峰；半夏主要含淀粉和氨基酸、大棗主要含多糖和氨基酸，這幾類成分水溶性大，含量低，且不具備HPLC-UV檢測的結構特點，致使它們在此色譜條件下不能檢出。方中人參主要含皂苷類物質，為末端吸收，且該類成分不穩定，在此色譜條件下未能檢測，建議對人參單獨建立特征圖譜[19]。

中藥質量是中藥產業發展的生命線，中藥質量研究方面存在的諸多問題將制約中藥產業的健康與可持續發展[20]。Q-Marker的建立有利于中藥全程質量控制及質量溯源，是中藥質量評價與控制的指標。基于特征圖譜和網絡藥理學研究，黃連湯中黃連堿、巴馬汀、小檗堿、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、6-姜辣素7個成分均具有傳遞性和溯源性，且與功能屬性密切相關，可初步預測其為黃連湯的潛在Q- Marker。

本研究基于中藥化學與中藥藥理學，整合多學科技術方法，基于可測性、可追溯性、有效性開展黃連湯功效關聯物質的系統辨識與確認，為后期深入研究黃連湯的作用機制提供借鑒，也為黃連湯的質量控制提供了更全面的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突