不同眼壓狀態下實驗性青光眼視網膜神經節細胞p53基因表達

李素美 王文奇

(1淮安市洪澤區人民醫院，江蘇 淮安 223100；2淮安市第一人民醫院)

青光眼主要表現為眼紅、夜盲、虹視、視物模糊、眼痛、頭痛等，嚴重可導致失明〔1〕。因患者早期癥狀不明顯或無癥狀常錯過了最佳治療時機，發現時病情已發展到中晚期，視覺功能損傷嚴重致失明〔2〕。晚期青光眼致盲是目前人類最主要的致盲原因，且這種致盲是不可逆的，如何有效地保護青光眼患者的視覺功能是當前眼科的難題之一〔3〕。近年來臨床研究認為造成青光眼患者視覺功能損傷與視網膜神經節細胞(RGCs)死亡相關〔4〕。而RGCs的死亡則是通過細胞凋亡來完成的，目前已知的激發RGCs凋亡的因素較多，但這些因素都是利用信號傳導影響細胞內控制凋亡的相關基因完成的〔5〕。p53基因在誘導RGCs凋亡中有重要的作用〔6〕。醫學界針對青光眼的相關研究很多，但缺乏關于不同眼壓狀態下RGCs細胞內控制凋亡基因的研究。本研究通過檢測不同眼壓狀態下p53基因的表達，探討其對青光眼RGCs凋亡作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 SD小鼠RGC-5細胞系，選購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。DMEM培養基：北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清：美國Corning公司；胰蛋白酶消化液：北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠單克隆體P53：美國Santa 公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；Hoe33342染色液：美國MedChemExpress公司；聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒：美國TaKa-Ra公司；Western印跡試劑盒：基爾頓生物科技(上海)有限公司；CO2恒溫細胞培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；IX70型倒置相差顯微鏡：徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；流式細胞儀：美國Beckman Coulter公司；熒光顯微鏡：徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；紫外投射儀：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 在含有10%胎牛血清的DMEM培養基，溫度為37℃，體積數為5% 的CO2恒溫細胞培養箱中進行RGC-5細胞培養，3～4 d用0.25%的胰蛋白消化傳代1次，傳代比例為1∶4〔7〕。

1.2.2實驗分組 RGC-5細胞(對數期生長的)以每孔8×103的密度在96孔培養板上進行接種，培養24 h后，分為4組：對照組、20 mmHg壓力組、40 mmHg組、60 mmHg組。對照組僅進行密封處理，不加壓，壓力組分別用20、40和60 mmHg的密封加壓裝置處理，將經處理的細胞分別放入各自的培養箱中48 h，然后用倒置相差顯微鏡對各組的細胞狀態進行觀察記錄〔8〕。

1.2.3流式細胞儀檢測 使用Annexin V-FITC和PI細胞凋亡檢測試劑盒來進行檢測，按說明書操作。首先收集加壓培養后的RGC-5細胞，用預冷處理過的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；在結合緩沖液中懸浮置入洗滌的細胞〔9〕。然后分別添加Annexin V-FITC和PI，進行15 min避光孵育。最后添加結合緩沖液混合均勻，用流式細胞儀分析〔10〕。

1.2.4半定量RT-PCR檢測 加壓培養后，選取RGC-5細胞(1×105個)通過Trizol一步法進行RNA提取，再用Oligo(dT)進行逆轉錄反應獲得cDNA。以Genbank上的基因序列為依據進行引物設計，分別用p53引物和內參GAPDH引物行PCR〔11〕。其反應體系為25 μl，反應條件為：5 min 95℃預變性，余下的34個循環50 s 95℃變性，50 s 55℃退火，50 s 72℃延伸，最后5 min 72℃延伸，共行35個循環〔12〕。利用瓊脂糖凝膠(購自：武漢沃軒科技有限公司，內含1%花青素)電泳對PCR產物進行鑒定，同時通過紫外透射儀觀察拍照，凝膠成像系統分析。

1.2.5Western印跡檢測 加壓培養后，收集RGC-5細胞并用細胞裂解液進行30 min裂解。然后在4℃的環境下，以12 000 r/min的速度進行5 min離心處理，提取上清液，加入上樣緩沖液后在沸水中煮5 min，用濃度為10%的十二烷基硫代硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離〔13〕。電泳結束后，脫奶粉(5%)封閉1 h，加入比例為1∶1 000的一抗，4℃過夜〔14〕。進行30 min的TBST液漂洗后，加入比例為1∶2 000的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下孵育30 min，用TBST液漂洗1 h，ECL染色〔15〕。掃描得出圖像，需重復3次獨立實驗。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞形態及存活狀況 對照組細胞形狀為梭形且有較多樹突，各壓力組細胞輪廓不清，皺縮細胞變多，有些細胞樹突變少、變短，有些細胞內出現空泡。而且壓力越大，細胞異常表現越明顯，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態及存活狀況(×100)

2.2各組細胞凋亡情況比較 隨著壓力數值的上升，凋亡和壞死細胞比例均顯著高于對照組(均P<0.05)。見圖2和表1。

圖2 各組細胞流式細胞儀檢測下細胞凋亡

表1 各組凋亡和壞死細胞比例比較

2.3各組細胞p53 mRNA表達和蛋白表達 與對照組相比，各加壓組細胞p53 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加，且與20 mmHg壓力組相比，40 mmHg壓力組和60 mmHg壓力組p53 mRNA和蛋白表達水平上調更顯著(P<0.05)。見圖3，4，表2。

1～4：對照組，20 mmHg壓力組，40 mmHg壓力組，60 mmHg壓力組圖3 各組細胞在不同壓力下P53的mRNA表達

1～4：對照組，20 mmHg壓力組，40 mmHg壓力組，60 mmHg壓力組圖4 各組細胞在不同壓力下p53的蛋白表達

表2 各組 p53 mRNA 和蛋白表達水平比較

3 討 論

目前臨床研究已證實，RGCs進行性死亡和視神經纖維丟失是青光眼患者眼壓上升的主要因素之一〔16〕。本研究結果證明壓力可導致RGCs出現死亡，且壓力大小與細胞損傷程度成正比。張虹等〔17〕將經過純化培養的SD系大鼠視網膜神經節細胞分別施加0、20、40、80 mmHg的氣壓，在培養箱中進行48 h培養后對細胞的凋亡狀況進行檢測，隨著壓力數值的上升，細胞凋亡指數增高，證明壓力會導致RGCs凋亡，且壓力越高細胞凋亡越嚴重，且高壓力會增加細胞早期凋亡進程。

RGCs凋亡是一個極其復雜又涉及多層面、多因素的過程〔18〕。因為各層面各因素間是彼此聯系又相互影響制約的，現在研究的尚不能對其發病機制進行明確闡述〔19〕。但在目前已知的能調節細胞凋亡的因素中，與RGCs凋亡相關性較強的就是p53基因。p53基因是促進細胞凋亡的抑癌基因，因其會產生一種名為53 kD的核蛋白而得名〔20〕。其基因分為野生型和突變型兩種，野生型通過讓細胞周期停留在G1期，來控制細胞的繁殖從而使其凋亡；突變型則為突變基因無誘導細胞凋亡的作用〔21〕。當細胞DNA出現損害時，為了使其有時間進行損傷修復，p53先會誘使細胞停留在G1期；但當DNA損傷過于嚴重不能修復時，p53則會誘使細胞凋亡，以此達到清除壞死細胞的目的。