LncRNA LINC00277通過(guò)與miR-27b結(jié)合調(diào)控p53表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移

宋殿芳 賈素敏 徐沖

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1婦產(chǎn)科，山東 濱州 256600；2臨床實(shí)驗(yàn)中心)

宮頸癌是女性中常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其已嚴(yán)重威脅女性健康，宮頸癌早期診斷準(zhǔn)確率較低與患者預(yù)后差是亟待解決問(wèn)題，研究表明宮頸癌發(fā)生與人乳頭狀瘤病毒感染相關(guān)，而單獨(dú)人乳頭狀瘤病毒感染并不是引起宮頸癌的主要原因〔1〕。既往研究顯示原癌基因激活與抑癌基因失活及其涉及多種信號(hào)通路可參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔2〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)可參與基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾等多種過(guò)程，并可參與乳腺癌、肝癌及宮頸癌等發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔3〕。LncRNA LINC00277在人乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的宮頸癌形成過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未可知〔4〕。研究表明HPV16 E7可通過(guò)調(diào)控miR-27b進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡〔5〕。miR-27b-3p在宮頸癌中上調(diào)表達(dá)，并可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及遷移〔6〕。p53屬于抑癌基因，p53在許多癌癥中發(fā)揮抑癌作用〔7〕。通過(guò)生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-27b可能是LINC00277的靶基因，p53可能為miR-27b的靶基因，但LINC00277是否可通過(guò)調(diào)控miR-27b/p53進(jìn)而參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程尚未可知。因此，本研究著重探討LINC00277在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，分析其對(duì)miR-27b/p53的調(diào)控作用，為揭示宮頸癌發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2015年3月至2017年2月山東省濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的宮頸癌患者36例為研究對(duì)象，所有患者經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為宮頸癌，年齡55～70〔平均(63.25±6.26)〕歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌病理類(lèi)型均為腺癌；生存時(shí)間超過(guò)6個(gè)月；患者病理分期為Ⅱ期或Ⅲ期患者〔8〕；依從性強(qiáng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受放療、化療等；合并其他惡性腫瘤者；既往心肌梗死等心血管疾病者；心、腎等臟器功能受損者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情且簽署同意書(shū)。所有患者于術(shù)中切除宮頸癌組織(36例)及癌旁組織(28例)，迅速放入液氮中，術(shù)后將其轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2材料與試劑 宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa與正常宮頸細(xì)胞系E6E7均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院中國(guó)細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-27b mimics及其陰性對(duì)照mimic-NC、miR-27b inhibitor及其陰性對(duì)照miR-NC均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒、蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；目的質(zhì)粒pcDNA3.1與空白質(zhì)粒pcDNA3.1均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；兔抗人p53抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌Hela細(xì)胞，接種于6孔板，放入不含血清及青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將pcDNA-LINC00277、pcDNA-NC、miR-27b mimics、mimic-NC、miR-27b inhibitor、miR-NC分別轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞，分別為pcDNA-LINC00277組、pcDNA-NC組、mimic-miR-27b組、mimic-NC組、inhibitor-miR-27b組、miR-NC組，同時(shí)將pcDNA-LINC00277與mimic-miR-27b共轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞，pcDNA-LINC00277與miR-NC共轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞，分別為pcDNA-LINC00277+mimic-miR-27b組、pcDNA-LINC00277+miR-NC組，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LINC00277、miR-27b表達(dá)水平 收集宮頸癌組織及癌旁組織，研磨后加入Trizol試劑提取組織RNA，同時(shí)收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系，qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃ 2 min，(95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s)×40次循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00277、miR-27b相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，按照1.3.1轉(zhuǎn)染后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔分別加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，分別于溶解后的0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)放入酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡率，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌宮頸癌Hela細(xì)胞，4℃，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑6 cm)，加入PBS洗滌細(xì)胞，4℃，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑6 cm)，棄上清，加入200 μl結(jié)合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI，充分混勻，室溫避孵育20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 用100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋800 μl Matrigel基質(zhì)膠，取100 μl稀釋液鋪于Transwell小室上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基500 μl加入Transwell小室下室，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，擦去未侵入細(xì)胞表面的細(xì)胞，采用多聚甲醛固定侵入Transwell小室下室的細(xì)胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，干燥后置于顯微鏡下拍照并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取不含血清的DMEM培養(yǎng)基100 μl放入Transwell小室的上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基500 μl加入Transwell小室下室，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3.6Western印跡檢測(cè)p53蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA、PMSF裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取20 μg蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(1∶1 000)，4℃條件下孵育24 h，TBST洗膜3次×5 min，室溫條件下孵育二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜3次×5 min，滴加ECL發(fā)光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LINC00277、miR-27b及p53的靶向關(guān)系 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)LINC00277的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建含有LINC00277與miR-27b的結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體LINC00277-wt，構(gòu)建含有LINC00277與miR-27b突變結(jié)合位點(diǎn)的突變型載體LINC00277-mut，同時(shí)將宮頸癌Hela細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)將LINC00277-wt與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞，將LINC00277-mut與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞。使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-27b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建含有p53與miR-27b的結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體p53-wt，構(gòu)建含有p53與miR-27b突變結(jié)合位點(diǎn)的突變型載體p53-mut，同時(shí)將宮頸癌Hela細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)將p53-wt與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞，將p53-mut與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，每孔分別加入60 μl細(xì)胞裂解液，低速振蕩20 min，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA LINC00277在宮頸腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量 LINC00277在宮頸癌組織中的表達(dá)水平(0.52±0.05)顯著低于癌旁組織(1.95±0.20，P<0.05)；宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞中LINC00277的表達(dá)水平(0.75±0.08，0.83±0.06)均顯著低于E6E7細(xì)胞(2.41±0.21，P<0.05)，其中在宮頸癌Hela細(xì)胞中LINC00277的表達(dá)水平降低最為顯著。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對(duì)象。

2.2LncRNA LINC00277在體外的表達(dá)量對(duì)細(xì)胞增殖和活力的影響 pcDNA-LINC00277組宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性低于pcDNA-NC組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率高于pcDNA-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。

圖1 過(guò)表達(dá)LINC00277時(shí)細(xì)胞的凋亡率

表1 過(guò)表達(dá)LINC00277對(duì)Hela細(xì)胞增殖活性的影響

2.3LncRNA LINC00277在體外的表達(dá)量對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響 pcDNA-LINC00277組細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于pcDNA-NC組(均P<0.05)，見(jiàn)圖2和表2。表明LINC00277過(guò)表達(dá)可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞遷移及侵襲能力。

圖2 過(guò)表達(dá)LINC00277對(duì)細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表2 過(guò)表達(dá)LINC00277對(duì)細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響個(gè))

2.4LncRNA LINC00277可以靶向miR-27b 宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-27b的表達(dá)水平(1.27±0.12)顯著高于正常宮頸細(xì)胞E6E7(0.56±0.05，P<0.05)。靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站顯示miR-27b與LINC00277的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 LINC00277和miR-27b的結(jié)合位點(diǎn)

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與mimic-NC、LINC00277-wt共轉(zhuǎn)染組相比，mimic-miR-27b、LINC00277-wt共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。pcDNA-LINC00277組miR-27b的表達(dá)水平(0.52±0.05)顯著低于pcDNA-NC組(1.46±0.13，P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5miR-27b可靶向調(diào)控p53表達(dá) 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與mimic-NC、p53-wt共轉(zhuǎn)染組相比，mimic-miR-27b、p53-wt共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站顯示miR-27b與p53的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。Hela細(xì)胞中p53的表達(dá)水平(0.68±0.06)顯著低于正常宮頸細(xì)胞E6E7(1.53±0.12，P<0.05)。inhibitor-miR-27b組宮頸癌Hela細(xì)胞中p53的表達(dá)水平顯著高于inhibitor-miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖5和表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖4 miR-27b和p53的結(jié)合位點(diǎn)

圖5 Western印跡檢測(cè)干擾miR-27b對(duì)p53蛋白表達(dá)水平的影響

表5 干擾miR-27b對(duì)p53表達(dá)量的影響

2.6LINC00277可與miR-27b結(jié)合調(diào)控p53的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移 pcDNA-LINC00277+mimic-miR-27b組p53的表達(dá)水平顯著低于pcDNA-LINC00277+miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性高于pcDNA-LINC00277+miR-NC組(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著多于pcDNA-LINC00277+miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 LINC00277可與miR-27b結(jié)合調(diào)控p53的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活力、遷移和侵襲

3 討 論

人乳頭狀瘤病毒的預(yù)防性疫苗可有效預(yù)防宮頸癌，但其對(duì)宮頸癌晚期患者治療效果較差，目前宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明〔9〕。因而探究宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的分子機(jī)制并尋找有效診斷的分子治療靶點(diǎn)對(duì)提高宮頸癌治療效果有重要意義。研究表明LncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔10〕。已有報(bào)道指出LncRNA GAS5、LncRNA H19等表達(dá)異常可能參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，并可為宮頸癌分子靶向治療提供理論依據(jù)〔11〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明LINC00277在宮頸癌中呈低表達(dá)并可能發(fā)揮抑癌基因作用。LINC00277過(guò)表達(dá)可通過(guò)降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力及增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力進(jìn)而抑制宮頸癌發(fā)生及發(fā)展。研究表明miR-27b在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可通過(guò)靶向抑制HMG3表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔12〕。miR-27b在口腔鱗癌細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)miR-27b表達(dá)可通過(guò)靶向抑制FZD7表達(dá)進(jìn)而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖〔13〕。miR-27b通過(guò)靶向NR2F2抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲〔14〕。但miR-27b在宮頸癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變，侵襲及減少細(xì)胞凋亡〔15〕。LncRNA ZEB2-AS1可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-27b進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡〔16〕。這可能與腫瘤細(xì)胞類(lèi)型不同相關(guān)。提示LINC00277可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-27b而抑制miR-27b表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miRNA通過(guò)靶向抑制下游靶基因表達(dá)進(jìn)而參與多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)顯示p53可能是miR-27b的靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-27b可靶向結(jié)合p53，并可負(fù)向調(diào)控p53表達(dá)，研究表明上調(diào)p53表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡〔17～19〕。二甲雙胍可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1和p53表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡〔20〕。本研究結(jié)果提示LINC00277可通過(guò)調(diào)控miR-27b/p53表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上，LINC00277過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制miR-27b表達(dá)而上調(diào)p53表達(dá)進(jìn)而減弱宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，LINC00277可能成為宮頸癌潛在治療分子靶點(diǎn)及預(yù)后的生物標(biāo)志物，并可能應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)控宮頸癌發(fā)病進(jìn)展，為宮頸癌遷移及侵襲提供新的作用靶點(diǎn)。