miR-506-3p通過靶向IQGAP1基因抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的體外研究

王小蕊 董非斐 何碧凝 黎克行

(三亞市人民醫院內分泌科，海南 三亞 572000)

甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是甲狀腺癌最常見的病理類型，約占所有甲狀腺癌的80%〔1〕。近年來，隨著甲狀腺癌綜合治療技術的不斷提高，大多數PTC患者預后良好，但局部復發和遠處轉移患者經臨床治療后預后效果較差〔2〕。因此，探索甲狀腺癌發生發展的分子機制，尋求新的靶向治療位點，對改善甲狀腺癌患者的預后、提高其生存率具有重要意義。IQ結構域GTP酶激活蛋白(IQGAP)1是一種進化保守的多域支架蛋白，可參與調控細胞附著、細胞遷移、細胞外信號轉導和細胞分裂等多種細胞過程〔3〕。有報道〔4〕稱IQGAP1在PTC中表達上調，下調IQGAP1表達可明顯抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖能力、遷移和侵襲。miRNA是多種細胞過程的重要調控因子，近年來的研究發現，異常表達的miRNA參與癌癥的發生發展。有研究〔5〕表明，miR-506-3p在非小細胞肺癌組織和細胞中表達下調，過表達miR-506-3p可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。但尚無miR-506-3p在甲狀腺癌中的相關研究，且miR-506-3p是否通過調控IQGAP1表達影響甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲目前尚不可知。本研究通過體外實驗探討miR-506-3p靶向IQGAPl表達對甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1材料與主要試劑、儀器 甲狀腺癌細胞SW579、FTC-133、KAT-18和正常甲狀腺上皮細胞TEC購于美國ATCC。胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養基購于美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉染試劑和TRIzol抽提試劑購于美國Invitrogen公司；PCR引物、miR-506-3p模擬物，miR-NC、si-IQGAP1載體、si-NC、WT-IQGAP1及MUT-IQGAP1由北京華大基因公司構建和測序；雙熒光素酶報告基因檢測系統購于美國Promega公司；細胞組織快速裂解液(RIPA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western洗滌液及吐溫-20購于上海碧云天公司；兔抗IQGAPl、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、P27、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-14抗體購于美國Santa Cruz公司；抗兔二抗購于武漢博士德公司。噻唑藍(MTT)試劑、Transwell小室和酶標儀購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，倒置顯微鏡購自日本Nicon公司。

1.2細胞培養與轉染 選取甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、KAT-18和甲狀腺上皮細胞TEC，在37℃，濕度飽和，CO2體積分數5%的細胞培養箱中，用含10% FBS RPMI1640培養基進行傳代培養。取對數生長期的SW579細胞，以2×105個/孔細胞數接種于6孔板上，當細胞融合度達到50%時，按照LipofectamineTM2000說明書將miR-506-3p、miR-NC、si-IQGAP1、si-NC、pcDNA-IQGAP1和pcDNA轉染SW579細胞。細胞分組為miR-506-3p組(轉染miR-506-3p mimics)、miR-NC組(轉染miR-NC)、si-IQGAP1組(轉染si-IQGAP1)、si-NC組(轉染si-NC)、miR-506-3p+pcDNA組(轉染miR-506-3p和pcDNA)和miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1組(轉染miR-506-3p和pcDNA-IQGAP1)。

1.3qRT-PCR檢測 按照Trizol說明書分別提取甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、KAT-18和甲狀腺上皮細胞TEC及各組SW579細胞的總RNA，檢測其濃度和純度后，逆轉錄為cDNAs，隨后進行qRT-PCR擴增。引物序列如下：miR-506-3p正義：5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′；反義：5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′。U6正義：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-A-3′；反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。IQGAP1-正義：5′-AGAACGTGGCTTATGAGTACCT-3′；反義：5′-CCAGTCGCCTTGTATCTGGT-3′。GAPDH正義：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′；反義：5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。miR-506-3p和IQGAP1 mRNA的檢測分別以U6和GAPDH為內參，用2-△△Ct法測定miR-506-3p和IQGAP1 mRNA的相對表達量。

1.4MTT法檢測細胞活力 取對數生長期SW579細胞，按照1.2細胞轉染方法，獲得各組轉染細胞。分別于培養24、48、72 h時，每孔加入20 μl的MTT溶液室溫反應4 h后，吸去孔內上清液，每孔再加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，緩慢搖動5 min至完全溶解。用酶標儀在490 nm處測各孔的OD值(以空白孔進行調零)。

1.5Transwell法檢測細胞侵襲和侵襲 取轉染48 h的各組SW579細胞，胰酶消化后離心吸去上清，用無血清的RPMI1640培養基調整細胞濃度為1×105個/ml，于上室中加入200 μl細胞懸液，下室加入500 μl含10%FBS的RPMI1640培養基，將Transwell小室放置于37℃，5% CO2的細胞培養箱培養24 h后，擦去上室膜上未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定下室膜10 min。自然晾干后，0.4%臺盼藍染色5 min。棄染液，雙蒸水洗2次。取出后于倒置顯微鏡(40×)下觀察拍照，統計上、下、左、右、中5個不同視野的總細胞數取平均值。

Transwell侵襲實驗：將基質膠和RPMI1640培養基按1∶8稀釋后(60 μl)鋪于培養小室上，風干后備用，其他步驟同Transwell體外遷移實驗。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預測數據庫Targetscan網站(http://www.targetscan.org/vert/)預測miR-506-3p的靶基因。發現miR-506-3p的5′端可與IQGAP1的3′-UTR特異性結合，猜測IQGAP1是miR-506-3p的靶基因。為驗證這一猜想，構建野生型WT-IQGAP1和突變型MUT-IQGAP1的IQGAP1 3′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-506-3p和miR-NC分別與WT-IQGAP1和MUT-IQGAP1共轉染SW579細胞。轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.7Western印跡檢測 收集轉染48 h的各組SW579細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白，并用BCA試劑盒進行蛋白定量。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜，用洗滌液洗膜2 min后加入吐溫-20室溫封閉2 h，吸盡封閉液后，在4℃下加入抗IQGAP1、GAPDH、CyclinD1、P21、P27、MMP-2、MMP-9和MMP-14一抗(1∶500)孵育過夜，用洗滌液洗膜3次后，在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶500)孵育膜2 h，洗膜3次后于暗室加入顯色液進行顯色并拍照，用Image Quant軟件分析目的條帶灰度值。以GAPDH作為內參。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-506-3p和IQGAP1在甲狀腺癌細胞和正常甲狀腺上皮細胞中的表達 與正常甲狀腺上皮細胞TEC比較，甲狀腺癌細胞SW579、FTC-133和KAT-18中miR-506-3p的表達均顯著降低，IQGAP1 mRNA和IQGAP1蛋白的表達均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 miR-506-3p和IQGAP1在甲狀腺癌細胞和正常甲狀腺上皮細胞中的表達

圖1 IQGAP1蛋白表達

2.2miR-506-3p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-506-3p組甲狀腺癌SW579細胞中miR-506-3p的表達顯著升高(P<0.001)，表明成功構建了過表達miR-506-3p的SW579細胞株。與miR-NC組比較，miR-506-3p組甲狀腺癌SW579細胞在24 h的增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力顯著減弱，細胞增殖相關蛋白CyclinD1的表達顯著降低，P21和p27蛋白的表達顯著升高(P<0.001)。表明過表達miR-506-3p可抑制甲狀腺癌細胞的增殖。見圖2，表2。

圖2 增殖相關蛋白表達

表2 miR-506-3p過表達對甲狀腺癌SW579細胞增殖的影響

2.3miR-506-3p過表達對甲狀腺癌SW579細胞遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-506-3p組甲狀腺癌SW579細胞中遷移和侵襲細胞數均顯著減少，侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9和MMP-14的表達顯著降低(P<0.05)。表明過表達miR-506-3p可抑制甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲。見圖3、表3。

圖3 遷移侵襲相關蛋白表達miR-506-3p過表達對甲狀腺癌SW579細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫，×200)

表3 miR-506-3p過表達對甲狀腺癌SW579細胞遷移、侵襲的影響

2.4抑制IQGAP1表達對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-IQGAP1組甲狀腺癌細胞SW579中IQGAP1蛋白的表達較si-NC組顯著降低(P<0.05)，表明成功構建了IQGAP1抑制表達的甲狀腺癌SW579細胞株。與si-NC組比較，si-IQGAP1組甲狀腺癌SW579細胞在24 h、48 h和72 h的增殖活力顯著減弱，遷移和侵襲細胞數均顯著減少，細胞增殖相關蛋白CyclinD1和侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達顯著降低，P21蛋白的表達顯著升高(均P<0.05)。表明抑制IQGAP1表達可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。見表4，圖4。

表4 抑制IQGAP1表達對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 IQGAP1和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.5miR-506-3p靶向調控IQGAP1的表達 miR-506-3p與IQGAP1-3′UTR之間存在特異性結合位點。野生型IQGAP1基因表達載體WT-IQGAP1和miR-506-3p mimics共轉染甲狀腺癌細胞SW579后，miR-506-3p組SW579細胞熒光素酶活性(0.42±0.04)與再轉染miR-NC組(1.03±0.09)顯著降低(P<0.05)；而突變型IQGAP1基因表達載體MUT-IQGAP1和miR-506-3p mimics共轉染甲狀腺癌細胞SW579后，miR-506-3p組SW579細胞熒光素酶活性(1.04±0.09)與再轉染miR-NC組(1.05±0.08)差異不顯著(P>0.05)。與miR-NC組(0.63±0.06)比較，miR-506-3p組SW579細胞IQGAP1蛋白的相對表達量(0.24±0.03)顯著減低；與anti-miR-NC組(0.61±0.06)比較，anti-miR-506-3p組SW579細胞IQGAP1蛋白的相對表達量(0.96±0.08)顯著升高(P<0.05)。見圖5。表明在SW579細胞中，IQGAP1是miR-506-3p的靶基因，miR-506-3p可負性調控IQGAP1的表達。

1～4：miR-NC組，miR-506-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-506-3p組圖5 miR-506-3p靶向調控IQGAP1的表達

2.6IQGAP1過表達逆轉了miR-506-3p過表達對SW579細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與miR-NC組比較，miR-506-3p組SW579細胞IQGAP1蛋白的表達顯著降低(P<0.05)，在24 h的增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力顯著減弱，遷移和侵襲細胞數均顯著減少，細胞增殖相關蛋白CyclinD1和侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達顯著降低，P21蛋白的表達顯著升高(均P<0.05)；與miR-506-3p+pcDNA組比較，miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1組SW579細胞IQGAP1蛋白的表達顯著升高(P<0.05)，在24 h的增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力顯著增強，遷移和侵襲細胞數均顯著增加，細胞增殖相關蛋白CyclinD1和侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達顯著升高，P21蛋白的表達顯著降低(均P<0.05)。表明過表達IQGAP1可逆轉miR-506-3p過表達對SW579細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。見圖6、表5。

1～4：miR-NC組，miR-506-3p組，miR-506-3p+pcDNA組，miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1組圖6 IQGAP1和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表5 IQGAP1過表達逆轉了miR-506-3p過表達對SW579細胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

人類IQGAP蛋白家族包括IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3 3個成員，其中IQGAP1已被證實廣泛存在于人體組織中。作為支架蛋白，IQGAP1通過與各種效應因子或調節因子結合，在調控細胞骨架結構和細胞黏附方面發揮重要作用〔6〕。研究顯示〔7～9〕，IQGAP1在肺癌、乳腺癌和口腔鱗狀細胞癌等多種癌組織和細胞中高表達，與癌癥的侵襲轉移密切相關。如IQGAP1在胰腺癌中明顯上調，下調IQGAP1表達，可抑制胰腺細胞SW1990的增殖和轉移，并抑制腫瘤的形成〔10〕。miR-506是靈長類動物睪丸X染色體連鎖miRNA簇成員之一〔11〕，研究表明〔12〕，miR-506在不同類型的癌癥中發揮不同的作用。如miR-506在黑色素瘤中起癌基因作用，過表達miR-506可促進黑色素瘤細胞的生長、侵襲和遷移。然而，過表達miR-506-3p抑制骨肉瘤細胞增殖、促進細胞凋亡〔13〕；過表達miR-506-3p也可抑制鼻咽癌細胞的生長和轉移〔14〕。

本研究結果進一步驗證了Su等〔15〕甲狀腺癌細胞中IQGAP1高表達的結論。提示在甲狀腺癌中，上調miR-506-3p或下調IQGAP1可能通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白表達，促進P21和P27蛋白表達抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這與Liu等〔16〕敲除IQGAP1基因可抑制甲狀腺癌細胞侵襲的結論一致。雙熒光素酶報告基因檢測實驗和Western印跡檢測證實，IQGAP1是miR-506-3p的靶基因，miR-506-3p可負向調控IQGAP1的表達，這與Lin等〔17〕研究結果一致。轉染成功構建的IQGAP1過表達載體pcDNA-IQGAP1后，發現miR-506-3p對甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用在一定程度得到逆轉。提示miR-506-3p在甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程中發揮重要作用，miR-506-3p靶向調控IQGAP1表達參與其中。近年來，已發現miR-217、miR-539和miR-126等多種miRNA可通過下調其靶基因抑制甲狀腺癌細胞的增殖和轉移〔18～20〕。

綜上，miR-506-3p可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與miR-506-3p靶向下調IQGAP1有關，表明miR-506-3p可能是甲狀腺癌的一個有效的治療靶點。