柚皮苷通過miR-34a下調MET表達并抑制PI3K/AKT信號通路的激活調控甲狀腺癌細胞增殖和凋亡

汪冬梅 劉丹 郝鳳杰 王立東 王興波

(承德市中心醫(yī)院 1內分泌科，河北 承德 067000；2體檢中心)

甲狀腺癌(TC)是內分泌系統中最常見的惡性腫瘤。在過去30年，我國TC的發(fā)病率和死亡率逐年增加。TC可分為乳頭狀TC、濾泡狀TC、甲狀腺髓樣癌及間變性TC，其中乳頭狀TC占所有TC的70%～80%，而間變性TC只占所有TC的1%左右，但惡性程度最高，超過一半的TC患者死亡是間變性TC導致的。現代藥理學研究證實，中藥的有效成分對TC具有明顯的抑制作用，具有對患者副作用較小、治療途徑廣泛等特點。柚皮苷(NRG)是從柚子等柑桔類植物中提取的一種由葡萄糖、鼠李糖和柚配質的復合體，是一類天然類黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化應激、抗動脈粥樣硬化、保護心血管和抗腫瘤等作用〔1〕。有報道稱，NRG在治療異種移植食管癌小鼠的過程中表現出良好的抗腫瘤活性〔2〕；Erdogan等〔3〕報道，NRG可作為化療增敏劑，增強紫杉醇對前列腺癌細胞的毒性作用，從而抑制前列腺癌的增殖和轉移。MicroRNA(miRNA)是一種在真核細胞內廣泛分布的小分子非編碼RNA，參與了眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，其中就包括TC〔4,5〕。Chen等〔6〕研究表明，miR-34a在TC組織中的表達下調，且可通過靶向GLUT1調節(jié)與氟脫氧葡萄糖的親和力。Chen等〔7〕研究發(fā)現，NRG可通過調節(jié)miR-126/VCAN-1信號通路抑制非小細胞癌細胞的生長。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)參與了細胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節(jié)，近年來發(fā)現PI3K與其下游分子蛋白激酶B(AKT)所組成的信號通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，調節(jié)腫瘤細胞的增殖和凋亡等生物學過程。Cheng等〔8〕研究表明，NRG可通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活抑制大腸癌細胞的生長。此外，Li等〔9〕研究顯示，miR-34a也可以通過調節(jié)PI3K/AKT信號通路的激活抑制結直腸癌的進展。但到目前為止，NRG對TC是否有抗癌活性及其抗癌機制仍不明確，本文旨在探討NRG對TC的抗癌活性，并探究miR-34a和PI3K/AKT信號通路在TC中的作用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 NRG(純度：≥98%，規(guī)格：20 mg，批號：110722-201815)、MTT試劑、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒及ECL化學發(fā)光試劑盒購于中國Beyotime公司；RIPA裂解液購于中國Solarbio公司；ANNEXIN-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于中國Beyotime公司；青霉素、鏈霉素及DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒、SYBR GREEN試劑盒購于美國Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)試劑購于美國Sigma-Aldrich公司；反轉錄試劑盒購于美國Applied Biosystems公司；海腎熒光素酶psiCHECK2載體購于美國Promega公司。兔抗人MET單克隆抗體、PI3K單克隆抗體、p-PI3K單克隆抗體、AKT單克隆抗體和p-AKT單克隆抗體均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2細胞 人甲狀腺癌細胞系(乳頭狀TC細胞TPC-1、間變性TC SW1736細胞)和人正常甲狀腺Htori-3細胞購于中國科學院上海生命科學研究資源中心。

1.3儀器 BJPX-200恒溫培養(yǎng)箱(山東博科生物產業(yè)有限公司)；HBS-1096C酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；CyFlow Cube6流式細胞儀(廣州吉源生物科技有限公司)；A320離心機(上海友聲衡器有限公司)；FA2204G電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)；qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Mini-ProteanTetra小型垂直電泳槽(上海土森視覺科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1組織收集 收集承德市中心醫(yī)院手術切除的甲狀腺癌組織樣本及其對應的癌旁組織，患者在術前均已簽署知情同意書，且患者及其家屬均明確本研究的目的及意義，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.4.2細胞培養(yǎng) 將TPC-1和SW1736細胞接種于含10%胎牛血清(FBS)，100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2條件的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.4.3細胞轉染 取對數生長期的TPC-1和SW1736細胞，以1×105個/孔的密度接種至6孔板內，在37℃，5%CO2條件的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 ，使用Lipofectamine 2000試劑盒將miR-NC、miR-34a mimics轉染至細胞內繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組實驗重復3次。

1.4.4細胞處理 在37℃條件下，調整NRG濃度為6、12、25 μg/ml處理TPC-1和SW1736細胞12 h、24 h、48 h或72 h。收集處理后的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4.5MTT檢測細胞增殖 將TPC-1和SW1736細胞以2 000個/孔的密度分別接種至96孔板中，在培養(yǎng)箱中孵育24 h后使用濃度為6、12、25 μg/ml的NRG分別處理兩種細胞12、24、48或72 h。隨后將20 μg/ml的MTT試劑添加至各孔中，在37℃條件下繼續(xù)孵育4 h。最后加入150 μl DMSO終止孵育，使用酶標儀測定各孔在490 nm出的吸光光度(OD)值。每組實驗重復3次。

1.4.6流式細胞術檢測細胞凋亡 將TPC-1和SW1736細胞以1×106個/孔的密度分別接種至6孔板，在37℃條件下用使用濃度為6、12、25 μg/ml的NRG處理48 h，隨后使用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，在4℃條件下2 000 r/min離心5 min并收集沉淀。在室溫下使用5 μl的ANNEXIN-V-FITC和10 μl PI染色15 min。隨后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平，并通過FlowJo 10.6.2軟件分析數據。每組實驗重復3次。

1.4.7RT-qPCR檢測細胞內miR-34a及蛋白mRNA表達 根據TRIzol試劑盒說明書提取甲狀腺組織、TPC-1和SW1736細胞內總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。按照SYBR GREEN試劑盒說明書構建PCR體系，PCR如循環(huán)參數如下： 95℃持續(xù)5 min，95℃持續(xù)45 s，60℃持續(xù)45 s，72℃持續(xù)60 s，共進行40個擴增循環(huán)。以U6或GAPDH作為內參。結果采用2-ΔΔCt法進行計算。每組實驗重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.8Western印跡檢測細胞中MET及PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達 用濃度為6、12、25 μg/ml的NRG處理TPC-1和SW1736細胞48 h，使用RIPA裂解液收集細胞總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。在12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分理出50 mg的蛋白裂解物并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h后將稀釋后(1∶1 000)的一抗在4℃條件下孵育過夜，隨后與稀釋后(1∶2 000)的二抗在室溫下孵育2 h。最后使用ECL化學發(fā)光試劑盒顯影，使用ImageJ 1.52a軟件進行數據分析。每組實驗重復3次。

1.4.9雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-34a與MET的靶向關系 擴增MET后將其克隆至海腎熒光素酶psiCHECK2載體中，構建野生型MET質粒(MET-WT)。將MET突變后克隆至載體內構建突變型MET質粒(MET-MUT)。使用Lipofectamin 2000試劑盒將MET-WT和MET-MUT或miR-NC和miR-34a mmics共轉染至Htori-3細胞內，24 h后測定細胞內的熒光素酶活性。每組實驗重復3次。

1.5統計學處理 使用SPSS19.0統計學軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1NRG抑制TPC-1和SW1736細胞增殖并誘導細胞凋亡 與NRG共培養(yǎng)后，TPC-1和SW1736細胞的增殖受到明顯抑制(P<0.05)，呈現出明顯的劑量和時間依賴性。TPC-1和SW1736細胞經NRG處理后其凋亡率也顯著增加(P<0.05)，也呈現出明顯的劑量和時間依賴性。RT-qPCR檢測TPC-1和SW1736細胞內增殖相關蛋白mRNA的表達水平，結果顯示，經不同濃度NRG(0、6、12、25 μg/ml)處理48 h后，兩種細胞內cyclinD1 mRNA和c-Myc mRNA的表達水平逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)。同樣地，通過RT-qPCR檢測TPC-1和SW1736細胞內凋亡相關蛋白mRNA的表達水平，結果顯示，隨著NRG處理濃度的增加，兩種細胞內survivin mRNA和Bcl-2 mRNA的表達水平逐漸降低，但細胞內caspase-3 mRNA、Cleaved-caspase-3 mRNA及Bax mRNA的表達水平逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1，圖2，表2。

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05,2)P<0.01圖1 MTT實驗檢測TPC-1和SW1736細胞增殖

圖2 流式細胞術檢測TPC-1和SW1736細胞凋亡水平

表2 TPC-1和SW1736細胞內cyclinD1、c-myc蛋白及凋亡相關蛋白mRNA水平和細胞凋亡水平

2.2NRG抑制炎性介質在TPC-1和SW1736細胞中的表達 CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA在TC組織中的表達水平(2.36±0.13、2.01±0.16、1.89±0.11)明顯高于正常甲狀腺組織(1.00±0.02、0.98±0.06、1.00±0.05，P<0.01)。在TPC-1和SW1736細胞內CCR6(1.87±0.17、2.13±0.13)、CXCR4(1.64±0.17、2.13±0.12)和CXCR7 mRNA表達水平(1.72±0.16、1.97±0.12)也遠高于HTori-3細胞(1.00±0.01、1.00±0.03、0.99±0.04，P<0.05)。經過不同濃度NRG(0、6、12、25 μg/ml)處理后，TPC-1和SW1736細胞內CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA的表達水平逐漸降低，且呈現出明顯的劑量依賴性(P<0.05)，見表3。

表3 柚皮苷抑制TPC-1和SW1736細胞中炎性介質的表達

2.3NRG調控miR-34a和MET的表達并抑制PI3K/AKT信號通路的激活 miR-34a在TC組織和細胞中的表達均下調(P<0.01)；MET mRNA在TC組織和細胞內的表達增加(P<0.01)。不同濃度的NRG(0、6、12、25 μg/ml)處理后細胞內miR-34a表達水平顯著增加，且呈現出明顯的劑量依賴性(P<0.05)。隨著NRG濃度的增加，TPC-1和SE1736細胞內MET蛋白的表達量逐漸降低，呈現出劑量依賴性(P<0.05)。此外，隨著NRG濃度的增加，TPC-1和SW1736細胞內p-PI3K和p-AKT蛋白的表達量降低(P<0.05)，即NEG處理抑制了細胞內PI3K/AKT信號通路的激活(P<0.05)，見表4～6，圖3。

表4 RT-qPCR檢測miR-34a和MET mRNA在TC組織的表達水平

表5 RT-qPCR檢測miR-34和MET mRNA在細胞內的表達水平

表6 RT-qPCR檢測miR-34在不同濃度給藥組細胞內的表達水平

圖3 Western印跡檢測MET、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白在TPC-1和SW1736細胞內的表達水平

2.4上調miR-34a抑制MET的表達并抑制PI3K/AKT信號通路激活 轉染miR-34a mimics后，細胞內miR-34a的表達水平顯著增加(P<0.001)。Western印跡實驗結果顯示，過表達miR-34a顯著抑制TPC-1和SW1736細胞內MET蛋白的表達(P<0.05)。ENCORI預測結果顯示MET是miR-34a的下游靶基因，靶向結合序列見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗證實，過表達miR-34a顯著抑制野生型MET(MET-WT)的熒光素酶活性(0.36±0.04 vs 1.01±0.05，P<0.01)。MTT檢測TPC-1和SW1736細胞的增殖情況，結果顯示過表達miR-34a顯著抑制細胞的增殖能力(P<0.01)，且細胞內增殖相關蛋白cyclin D1和c-Myc mRNA的表達水平也顯著降低(P<0.01)。同樣地，過表達miR-34a顯著增強了對TPC-1和SW1736細胞凋亡的誘導作用(P<0.01)，細胞內凋亡相關蛋白survivin和Bcl-2 mRNA的表達受到明顯抑制(P<0.01)，caspase-3、cleaved caspase-3和Bax mRNA的表達量明顯增加(P<0.01)。Western印跡檢測結果顯示，過表達miR-34a也可以顯著抑制細胞內PI3K/AKT信號通路的激活(P<0.01)，且顯著抑制細胞內炎性介質CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA的表達(P<0.01)，見圖5～7,表7,圖8。

圖4 靶向結合序列

圖5 Western印跡檢測結果

與miR-NC組比較：1)P<0.05,2)P<0.01圖6 MTT檢測TPC-1和SW1736細胞增殖

圖7 流式細胞術檢測TPC-1和SW1736細胞凋亡水平

表7 上調miR-34a后TPC-1和SW1736細胞內蛋白、mRNA水平及細胞凋亡水平

圖8 MTT檢測TPC-1和SW1736細胞增殖

3 討 論

TC是分布較為廣泛的一種惡性腫瘤，隨著TC發(fā)病率的逐年上升，各國學者都在尋找新型且有效的治療方案〔10〕。NRG是柚皮中含量較為豐富的一種純天然黃酮化合物，在多種腫瘤中發(fā)現具有抗腫瘤活性〔11〕，因此在本項目中將明確NRG對TC的抗腫瘤作用。

本研究結果表明NRG以劑量和時間依賴性的方式抑制TPC-1和SW1736細胞的增殖。同時，NRG劑量依賴性地增加了TPC-1和SW1736細胞的凋亡。為明確其抑制TPC-1和SW1736細胞增殖和促進凋亡的分子機制，通過RT-qPCR檢測了兩種細胞內增殖和凋亡相關蛋白mRNA的表達水平。G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1是一個由人類CCND1基因編碼的蛋白質，屬于高度保守的細胞周期家族，可促進腫瘤的增殖并參與腫瘤的發(fā)生〔12〕。c-Myc癌基因是Myc基因家族的重要一員，是一種可使細胞獲得無限增殖和永生化功能的基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關〔13〕。在此項目中發(fā)現，隨著NEG濃度的增加，處理48 h后兩種細胞內cyclinD1和c-Myc mRNA的表達水平逐漸降低，且差異具有統計學意義，這也就解釋了NRG會以劑量依賴性的方式抑制TPC-1和SW1736細胞的增殖。凋亡抑制基因survivin是抗凋亡基因家族中的新成員，具有腫瘤特異性，只表達在腫瘤和胚胎組織中，與腫瘤的增殖、凋亡和轉移密切相關〔14〕。B淋巴細胞瘤(Bcl)-2是一種癌基因，具有明顯的抗凋亡作用〔15〕。capsapse-3是促進細胞凋亡的重要調節(jié)劑，在癌癥細胞中的表達下調抑制了癌細胞的凋亡〔16〕。Bax基因是與Bcl-2同源的蛋白，是Bcl-2基因家族中重要的促凋亡蛋白，Bax蛋白的過度表達可抑制Bcl-2基因的保護效應而促使細胞發(fā)生凋亡〔17〕。此項目中發(fā)現，survivin和Bcl-2 mRNA在兩種細胞內的表達隨著NRG劑量的增加而減少，且差異性顯著。與此相反的是，caspacse-3、cleaved caspase-3和Bax mRNA在兩種細胞內的表達水平隨著NRG濃度的增加而逐漸上調。總之，NRG通過抑制TPC-1和SW1736細胞內cyclinD1和c-Myc mRNA的表達抑制細胞的增殖，且呈現出明顯的劑量和時間依賴性。同時NRG通過抑制細胞內survivin、Bcl-2 mRNA的表達并上調caspase-3、cleaved caspase-3及Bax mRNA的表達，劑量依賴性地促進TPC-1和SW1736細胞的凋亡。

研究表明，患有甲狀腺炎的患者患TC的風險增加，且在TC患者的癌癥組織中常出現免疫浸潤〔18〕，提示炎癥反應可能是誘發(fā)TC的危險因素。趨化因子受體是參與和介導炎癥反應的化學因子，其中一些不僅由免疫細胞產生，而且在正常的甲狀腺細胞和TC細胞中產生，被認為與腫瘤進展和患者預后相關〔19〕。CCR6是趨化因子CCL20的唯一受體，CCR6與CCL20在許多預后不良的癌癥中表達增加，且在TC的多種細胞系中均發(fā)現了CCR6 mRNA的表達增加〔20〕。CXCR4是CXCL12的受體，是在TC中研究最多的趨化因子受體之一，通常情況下CXCR4在正常TC組織和細胞中基本不表達，而在TC組織和細胞系中的表達明顯升高〔21〕；有研究表明，過度表達的CXCR4還表現出了對癌細胞的抗凋亡作用，且增強了TC的轉移能力〔22〕。CXCR7通過與CXCL12和CXCL11結合，介導細胞的黏附、遷移增殖和凋亡〔23〕。Werner等〔24〕研究發(fā)現，CXCR7在TC組織和細胞系中的表達明顯升高，其表達水平也與淋巴結轉移相關。此外Zhang等〔25〕研究結果表明，CXCR7可通過調節(jié)PI3K/AKT信號通路的激活抑制TC細胞的增殖和遷移。在此項目中發(fā)現，CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA的表達水平在TC組織和細胞內的表達均顯著增加，但經過NRG處理后細胞內CCR6、CXCR4和CXCR7 mRNA逐漸降低，且呈現出濃度依賴性。上述研究結果也在一定程度上解釋了NRG對TPC-1和SW1736細胞增殖的抑制作用和對其凋亡的促進作用。

miR-34a位于人類1p36號染色體之上，通常被認為是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調節(jié)因子，其功能包括通過靶基因調節(jié)細胞的炎癥反應、增殖、遷移、凋亡及對化療藥物的敏感性〔26〕。研究顯示，miR-34a可通過與Bcl-2基因的靶向結合，抑制Bcl-2蛋白的翻譯從而發(fā)揮抗癌作用〔27,28〕。在此項目中發(fā)現，MET也是miR-34a的下游靶基因。研究顯示，MET是包括TC在內多種癌癥的潛在治療靶標，并且可以通過PI3K/AKT信號通路調節(jié)TC細胞的增殖〔29〕。此項目研究結果顯示，在TC組織和細胞內，miR-34a的表達量顯著降低，MET mRNA在TC組織和細胞中的表達水平明顯升高。經NRG處理后細胞內miR-34a的表達水平隨NRG濃度的增加逐漸升高，MET蛋白隨著NRG濃度的增加逐漸降低，且miR-34a負調控MET蛋白的表達。上述結果表明，miR-34a在TC組織和細胞中表達下調，MET的表達上調，且miR-34a可靶向負調控MET在細胞內的表達。另外，過表達miR-34a顯著抑制TPC-1和SW1736細胞的增殖，并顯著抑制cyclin D1和c-Myc mRNA在細胞內的表達。同樣地，過表達miR-34a也顯著增加了TPC-1和SW1736細胞的凋亡，并顯著影響survivin、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3和Bax mRNA的表達。

PI3K/AKT信號通路是經典的信號通路之一，參與多種人類癌癥的發(fā)生發(fā)展。磷酸化的PI3K(p-PI3K)刺激AKT的磷酸化，并因此影響腫瘤的生物學行為〔30〕。先前的研究已證實PI3K/AKT信號通路在TC中發(fā)揮作用。在此研究中發(fā)現，NRG可劑量依賴性的抑制PI3K的磷酸化，進而抑制PI3K/AKT信號通路的激活〔31〕。此外，過表達miR-34a也顯著抑制PI3K/AKT信號通路在TPC-1和SW1736細胞中的激活。