蘇格木勒-7對化療致卵巢功能低下大鼠的卵巢功能保護機制

春蓮 吳偉樂斯 布仁巴圖

(1內蒙古民族大學附屬醫院蒙醫婦科，內蒙古 通遼 028000；2包頭醫學院；3內蒙古民族大學附屬醫院)

蘇格木勒-7(蘇-7)雖然是傳統經典方劑，但目前的研究還處于初級階段(臨床療效觀察及簡單的藥理作用研究)〔1〕。蘇-7藥理作用主要是具有抗自由基、抗氧化及提高免疫力等作用〔2〕。而蘇-7在治療卵巢功能低下、保護卵巢功能、延緩卵巢衰老等方面尚無相關研究及報道。本課題組前期研究探索了蘇-7對化療性卵巢功能低下大鼠卵巢的功能保護作用研究，得出蘇-7對化療性卵巢功能低下大鼠的體重、卵巢及脾臟具有保護功能，并能提高免疫力、促進卵巢修復、促進卵泡發育成熟及排卵而恢復性周期，提高繁殖能力及新生鼠的生存率〔3〕。其中以1.0 g/(kg·d)和0.5 g/(kg·d)劑量蘇-7 療效較佳，本研究擬以此劑量做進一步的機制研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 10周齡健康 SD 雌性大鼠56只，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。實驗動物飼養于內蒙古民族大學附屬醫院動物實驗室。動物實驗均遵循動物保護與使用指南，并由內蒙古民族大學動物保護倫理委員會批準。

1.2動物分組 采用56只SD雌性大鼠，體重170～200 g。先適應性喂養7 d后禁食、不禁水10 h；第8天晨測體重并開始取陰道細胞檢測性周期，共10 d，剔除無規律性周期和無發情的鼠 8只，剩余48只正常性周期的雌性大鼠按體重排序從隨機數字表隨機區組法分4組(n=12)，分別為模型組即環磷酰胺組(CTX)、模型加蘇格木勒-7〔0.5 g/(kg·d)〕組即蘇-7-0.5、模型加蘇格木勒-7〔1.0 g/(kg·d)〕組即蘇-7-1.0、正常組。

1.3建立模型 除了正常組其他3組均連續7 d腹腔注射CTX 30 mg/(kg·d)，同時每天早上8點對大鼠進行陰道細胞涂片分析，一直到實驗結束。發情周期出現紊亂或無發情周期代表模型成功。

1.4藥物制備與給藥方法 蘇-7由內蒙古民族大學附屬醫院制劑室提供(符合 GPP 標準制劑室)。正常組和模型組等量生理鹽水灌胃，其余給藥組在造模第1天開始(建模同時)分別灌胃給予蘇-7-1.0 g/(kg·d)和蘇-7-0.5 g/(kg·d)，每天給藥1次，連續給藥24 d。

1.5血清及各臟器標本采集 造模7 d+給藥24 d后，剩余大鼠于動情間期進行麻醉后打開腹腔，腹主動脈取血，分離血清并送檢驗室以備酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、轉化生長因子(TGF)-β1水平變化。采血后迅速分離左側卵巢，分為兩部分，分裝在兩個速凍管內迅速置于液氮中，以備-80℃保存，用Western印跡法檢測相關蛋白表達；分離右側卵巢、稱重后用10%甲醛固定后送至病理科，做免疫組化法檢測相關蛋白的定位及檢測表達量。

1.6ELISA檢測 血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 評估化療及蘇格木勒-7對大鼠卵巢功能保護的機制。

1.7免疫組織化學法 分別對卵巢組織中生長分化因子(GDF)-9和骨形成態蛋白質(BMP)-15、8-羥基脫氧鳥苷(OHdG)、4羥基壬烯醛(HNE)、硝基酪氨酸(NTY)進行定位及表達量評價。

1.8Western印跡檢測 Bax、Bcl-2、超氧化物歧化酶(SOD)-2、血小板反應蛋白(TSP)-1、組織蛋白酶(Cathepin)D、骨髓基質細胞抗原(BST)1、補體因子-H(CFH)等蛋白表達量 Bax、Bcl-2是凋亡相關蛋白〔2，3〕；SOD是抗氧化酶〔9〕；其中TSP-1、CathepinD、BST1、CFH是前期臨床患者蛋白組學得出的差異蛋白，通過檢測大鼠卵巢組織中表達量來進一步驗證其結果。

1.9統計學方法 采用SPSS25.0軟件行方差齊性檢驗、單因素方差分析及非參數檢驗。

2 結 果

2.1蘇-7對化療性卵巢功能低下大鼠TNF-α、IL-6、TGF-β1的影響 與正常組相比，模型組TNF-α、IL-6水平顯著增高，TGF-β1水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，蘇-7-0.5組TNF-α、IL-6水平顯著下降，TGF-β1水平顯著增高(P<0.05)，見表1。

表1 各組TNF-α、IL-6、TGF-β1水平比較

2.2Western印跡檢測結果 與正常組比較，模型組卵巢內Bax、TSP-1、CFH表達顯著增高(P<0.01)，而蘇-7-1.0和蘇-7-0.5組與模型組相比明顯下降(P<0.05，P<0.01)；與正常組比較，模型組Bcl-2、SOD表達水平顯著下降(P<0.01)，而蘇-7-1.0和蘇-7-0.5組與模型組比較顯著增加(P<0.05，P<0.01)；其中蘇-7-0.5組與蘇-7-1.0組相比以蘇-7-0.5效果更佳。與正常組比較，模型組CathepinD表達量有所增加，但無顯著差異(P>0.05)，治療后有所下降，但無顯著差異(P>0.05)；模型組BST1表達量有所下降，但無顯著差異(P>0.05)，治療后也無升高，反而有降低趨勢。見表2。

表2 各組相關蛋白表達量比較

2.3免疫組織化學檢測結果 卵巢組織中8-OHdG、4HNE、NTY等氧化應激產物指標及生長因子指標在各組間無統計學意義(P>0.05)。CTX不會導致大鼠卵巢組織氧化應激反應及GDF-9和BMP-15表達量；蘇-7可能不通過改善氧化應激及生長因子相關指標起作用。見表3。

表3 免疫組化檢測各組相關蛋白表達量比較

3 討 論

卵巢是女性激素產生的重要器官，對女性的內分泌生殖起非常重要的作用，卵巢損傷引起的卵巢功能下降及卵巢功能提前衰退，將不可避免地導致過早絕經及生殖能力的喪失〔5〕。以往研究〔6～9〕已經證實CTX能引起67%的生育期女性絕經，另外完整的化療方案后只有0.6%的女性可以懷孕〔10，11〕。卵巢儲備功能良好才能有正常的卵巢功能，卵巢儲備取決于始基卵泡池的激活與卵泡閉鎖的速度〔5〕。本研究逼真的模擬了卵巢功能下降及卵巢早衰，發現蘇-7對化療性卵巢功能低下大鼠卵巢內分泌及生殖功能有改善及保護作用。Bcl-2蛋白家族成員是調節細胞凋亡的重要因子，調控著個體程序性細胞凋亡通路，其中包括抑制細胞凋亡，如Bcl-2和促進細胞凋亡Bax兩類功能相反的蛋白質〔12～14〕。Bax是一種重要的促凋亡蛋白，破壞線粒體外膜的完整性而導致促凋亡因子，如細胞色素c的釋放及細胞質中凋亡蛋白酶的激活〔15〕。本研究結果表明CTX組卵巢顆粒細胞凋亡明顯，蘇-7通過對抗卵巢顆粒細胞的凋亡，從而減少卵泡閉鎖，增加健康卵泡數目來改善及保護化療大鼠卵巢功能。

SOD是一個重要的抗氧化酶，本研究結果表明蘇-7通過增強大鼠卵巢組織抗氧化能力，抑制細胞凋亡，抑制卵泡提前閉鎖，增加健康卵泡數量而起到保護卵巢功能的作用。CTX可能對卵巢組織造成損傷，而TGF-β1表達降低，卵泡不能正常生長發育；低劑量的蘇-7可以促進卵巢損傷修復而TGF-β1分泌增高，促進卵泡生長發育，保護卵巢功能。

CFH參與免疫調節及補體激活過程，CFH升高提示組織損傷，本實驗結果與免疫相關炎癥因子TNF-α及IL-6的檢測結果相一致，進一步提示蘇-7能抵抗炎癥過程，促進組織損傷修復。

TSP-1是一種由衰老細胞產生的多種生物學功能的三聚體糖蛋白，組織器官中TSP-1的升高提示組織損傷的發生。陶潛等〔16〕研究發現，TSP-1是血管抑制因子，TSP-1的表達與卵巢間質微血管密度(MDV)呈負相關。TSP-1高表達可能在卵巢巧克力囊腫卵巢間質微血管網損傷及間質纖維化的發生、發展中起重要作用。本研究結果表明蘇-7能保護大鼠卵巢，其機制可能是蘇-7通過抑制TSP-1形成；另外有研究報道，TSP-1參與顆粒細胞凋亡〔9〕，本實驗結果也證明了TSP-1參與顆粒細胞凋亡這一結果；提示TSP-1可能通過參與卵泡顆粒細胞的凋亡過程，抑制TGF-β1激活，卵巢間質微血管網損傷及間質纖維化的發生等而影響卵泡的正常生長發育及促進卵泡閉鎖。而蘇-7可能通過降低TSP-1而促進卵巢組織損傷修復，促進卵泡生長發育，抵抗卵泡顆粒細胞的凋亡，減少卵泡閉鎖，抑制卵巢間質的纖維化，促進卵巢組織的修復而起到卵巢功能保護作用。

蘇-7通過抑制TNF-α、IL-6、CFH水平增高，抑制機體炎癥性損傷并保護機體器官功能；通過上調TGF-β1而促進顆粒細胞生長、增殖及促進卵泡發育成熟，增加竇狀卵泡數，并促進排卵從而提高大鼠的妊娠率。一方面通過提高SOD表達而提高卵巢組織抗氧化能力，抵抗化療至卵巢氧化應激狀態而抑制卵巢顆粒細胞凋亡及卵泡閉鎖，另一方面通過增加抗凋亡因子，降低促凋亡因子而防止顆粒細胞過早凋亡而抵制卵泡閉鎖，從而增加健康卵泡數目來保護化療大鼠卵巢儲備，改善卵巢功能。