68Ga-DOTATATE合成問題排查研究

趙 巖，孫占良，江 飛，呂太勇，劉 楠

1.西南醫科大學附屬醫院核醫學科（瀘州 646000）；2.四川省重點實驗室核醫學與分子影像（瀘州 646000）；3.四川省院士（專家）工作站（瀘州 646000）；4.西南醫科大學藥學院（瀘州 646000）

核醫學的推進與發展主要包括兩個方面：一是診斷設備如正電子發射斷層掃描儀（positron emission tomography，PET）和單光子發射計算機斷層掃描儀（single photon emission computed tomography，SPECT）方面的進展[1]，二是放射性藥物方面的進展[2-14]。隨著診斷設備的日漸成熟，放射性藥物的研究已經成為推動核醫學不斷向前發展的主要動力。放射性藥物從其放射性特點上可以分為兩個研究方面：首先是放射性藥物的標記合成研究[2-6]，其次是放射性藥物的核素生產研究[7-14]。

68Ga-DOTATATE的化學全稱是68Ga-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸-D-苯丙氨酸-1-酪氨酸-3-蘇氨酸-8-奧曲肽，是一種在PET顯像診斷中使用的放射性藥物，主要應用于定位診斷表達生長抑素受體（somatostatin receptor，SSR）的神經內分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasms，NENs）[15-19]，聯合MRI可以提高腫瘤性骨軟化癥診斷的特異性和準確性[20]。同時，在使用177Lu-DOTATATE 針對NENs 進行的肽受體放射性核素治療（peptide receptor radionuclide therapies，PRRT）時，68Ga-DOTATATE 可以作為對應的顯像劑在術前和術后為患者實行診斷和檢查[21-23]。

因為其成像效果優于第一個被批準用于NENs顯像的111In-噴曲肽（pentetreotide），該放射性藥物已于2016 年6 月1 日被美國的食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于NENs的診斷[19]。

68Ga-DOTATATE的合成生產過程相對18F-FDG更簡單，68Ga物理半衰期為68 min，一般由鍺鎵發生器（68Ge/68Ga generator）生產[10-14]，不需要加速器，標記反應可以使用全自動模塊或半自動模塊完成，也可以手動完成[24-26]。下面以使用ITG 半自動模塊為例，介紹68Ga-DOTATATE注射液的生產過程：安裝反應管線及產品瓶與廢液瓶，預熱模塊與反應管，溫度控制在80 ℃～100 ℃；將醋酸鈉緩沖溶液和DOTATATE前體混合后推入反應管，使用超純鹽酸淋洗鍺鎵發生器，將68GaCl3淋洗液推入反應管，反應液最佳pH范圍為3.5～4.5，加熱反應10～15 min；將反應液通過C-18固相萃取柱送入廢液瓶，用生理鹽水再次清洗C-18 柱；使用乙醇和生理鹽水淋洗C-18 固相萃取柱并經無菌濾膜過濾后送入產品瓶；測量廢液和產品活度，取微量產品液檢驗pH并通過高效液相 色 譜（high-performance liquid chromatograph，HPLC）檢測放射化學純度（簡稱放化純）[27-28]。

雖然68Ga-DOTATATE的標記方法已經成熟，但是因為國內醫院開展相關業務的單位仍然較少，對于合成過程中問題排查的研究還未見報道，本報告將分享標記實驗中問題的排查和解決，盼望幫助相關工作人員解決實際問題。

本院于2018 年開始開展68Ga-DOTATATE 的PET/CT 臨床科研診斷顯像[29-31]，該放射性藥物一直使用ITG 半自動模塊進行標記合成，每天的藥物標記由四位標記人員輪流完成，產品的放化純正常在98%以上。在2020年4月份中下旬，不同人員標記中出現了3次產品放化純低于98%，甚至低至90%，檢查相應的廢液，發現其活度高于正常水平，表明反應的標記率低于正常水平。

要查找原因，首先檢查反應的標記率，使用ITG模塊按照操作程序進行反應，不進行純化，測得標記率僅為42%，遠低于正常水平。造成標記率降低可能有如下幾種原因：首先是反應環境的酸堿度，如果反應液pH不在正常范圍內，標記率會明顯下降，當pH出現異常，說明鹽酸或者緩沖液的濃度有問題，可以進行相應的更換再次核驗pH；其次是反應液中所含每一種物質的純度，包括鹽酸、緩沖液與前體溶液，對于標記反應金屬雜質的濃度水平對反應的成敗至關重要，需要核驗這些物質是否被污染，對受污染的物質進行更換后，可以恢復標記率；最后是反應的物理儀器系統，像其它化學反應一樣，放射性標記反應需要在特定的溫度下進行，另外模塊使用管線系統是否有殘余或者漏夜，導致實際反應液中各種物質的比例改變，也會導致標記率降低。如果加熱系統出現故障不能提供相應溫度或者管線有問題，需要進行維修或更換以恢復標記率。本文將針對上面所列舉的可能性展開排查實驗，對問題進行溯源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

鹽酸（0.05 mol/L），使用超純鹽酸（Merck，Ultrapur，30%）和注射用水（四川美大康佳樂藥業）稀釋而成；醋酸鈉溶液（0.25 mol/L），使用無水超純醋酸鈉（Merck，Suprapur，99.99%）和注射用水配制而成；其它濃度的緩沖溶液也是使用不同濃度超純鹽酸和醋酸鈉配制而成；乙腈（賽孚瑞，HPLC/色譜純）；乙醇（Merck，Emprove）；廣范pH 試紙（pH 1～14，三愛思）、精密pH 試紙（pH 3.8～5.4，顯色反應間隔0.5，麥克林）；合成模塊所用管線（ITG）；C-18 固相萃取柱（Waters，Sep-Pak C18 Light）；除菌濾膜（Merck，vented Millex-GS，0.22 μm）；DOTATATE 前體（江蘇華益）。

放射性核素活度計（Capintec，CRC-55tR）；鍺鎵發生器（ITG）；68Ga半自動合成模塊（ITG）；恒溫混勻儀（寧波洛尚，Lawson，DHS-100）；數字溫度計（TP101，-50 ℃～300 ℃）；放射性HPLC（Lab Alliance）；pH計（雷磁，PHSJ-3F）。

1.2 質量控制

C-18反向色譜柱（Agilent，ZORBAX Eclipse C18 Plus，4.6 mm×250 mm，5 μm），放射性HPLC 流動相為：A泵，0.1%三氟乙酸乙腈溶液；B泵，0.1%三氟乙酸水溶液，洗脫梯度為：0～15 min，乙腈濃度10%～90%，流速為1 mL/min。

2 結果

2.1 pH核驗

0.05mol/L 稀鹽酸淋洗儲備液儲存于一個500 mL 的PP 瓶內，并定期分裝入100 mL PP 中轉瓶中。每次標記實驗都是從中轉瓶取鹽酸，當中轉瓶內鹽酸使用完后，再從備用瓶取鹽酸進入中轉瓶。分別從中轉瓶和備用瓶中取4 mL鹽酸，各加入1 mL醋酸鈉溶液與0.1 mL 水，模擬反應液的酸堿度，使用pH 計測量pH，平均值分別為3.6 和3.8。當用精密試紙測量時，顯示其pH 都低于3.8，沒有明顯差別。通過此驗證說明，反應液的pH 是處于最佳pH 范圍3.5～4.5之內。

2.2 緩沖溶液

反應液的酸堿度是合格的，接下來檢查了所使用的緩沖液，使用手動標記的方法，在獨立的恒溫混勻儀上，使用不同的緩沖液：①0.25 mol/L NaOAc 溶液300 μL，68Ga 淋洗液1200 μL，前體水溶液10 μg/45 μL；②NaOAc/HCl溶液（pH=4.4）300 μL，68Ga淋洗液1800 μL，前體水溶液10 μg/45 μL。測量標記率分別為98%和95%，從這里可以看到，使用不同的緩沖液的兩個反應都是正常，甚至使用醋酸鈉緩沖液的標記率更高。因為使用獨立搖動的加熱器增加了標記率，所以接下來對比了模塊和獨立加熱器的加熱效率差異，在這之前，需要驗證前體的濃度是否充足。

2.3 前體濃度

在正常藥物生產中，反應液的體積約為5 mL，包括4 mL68Ga 鹽酸淋洗溶液、1 mL 醋酸鈉溶液和0.1 mL 前體水溶液，投入的DOTATATE 前體質量為25 μg，前體在反應液中的濃度為5 μg/mL。由于鍺鎵發生器每次可提供的68Ga 鹽酸淋洗溶液只有4 mL，所以采取降低反應體積來進行對比實驗。

取三份常規體積1/10 的反應液，包括400 μL 0.05 mol/L68Ga鹽酸淋洗溶液和100 μL 0.25 mol/L醋酸鈉溶液，投入前體的質量分別設為1.25，2.5和5.0 μg，體積都是20 μL，這樣前體在反應液中的濃度分別為2.5，5 和10 μg/mL。使用恒溫混勻儀反應，測得標記率依次為99%，98%和98%。可以看出，當前體濃度降低到正常使用濃度的50%或者增加到兩倍時，反應標記率都正常。

在標記合成中一直使用ITG 模塊，到目前為止的實驗結果表明，在模塊上的標記率只有42%，而在恒溫混勻儀上，標記率可以達到98%，需要進一步檢查模塊的加熱器。

2.4 加熱器

將模塊和恒溫混勻儀的溫度控制設定為95 ℃，等待它們的溫度達到設定的溫度后，將帶有液體的反應管放在不同加熱器上，并分別記錄在這些加熱系統上所使用的不同反應管內液體隨時間的溫度變化曲線，見圖1。在模塊上反應管的溶液體積為5 mL，在恒溫混勻儀上反應管的溶液體積為2 mL，從結果可以看出獨立的加熱器的溫度上升比較快，兩個反應管內的液體在10 min 左右達到平衡溫度，它們的平衡溫度接近，大約為80 ℃。在恒溫混勻儀上的反應管溫度上升較快，有兩個可能的原因：首先，在恒溫混勻儀上，只能放2 mL 的離心管，相對模塊上可裝納5 mL 的反應管，溶液體積小，所以溫度上升快；其次，恒溫混勻儀帶有搖動功能，可以加快熱的傳遞，而模塊上的溶液是靜止加熱的。

圖1 ITG模塊與恒溫混勻儀上溶液溫度隨時間變化

注意，將加熱器的平衡溫度設在95 ℃，在ITG模塊上是通過模擬信號旋鈕來調控溫度的，恒溫混勻儀是通過數字信號來調控溫度，在被加熱的液體達到平衡溫度時，平衡溫度只達到了80 ℃，而不是95 ℃。雖然所使用的數字溫度計有可能和實際的真實溫度有偏差，但是使用的是同一個溫度計測量溫度的變化，所以這兩個被加熱的反應管的溫度變化不存在因不同溫度計而帶來的誤差。

2.5 反應時間

獲得這兩個加熱器的加熱效率的信息后，又進一步測量了在ITG 模塊上不同加熱時間的標記率，見表1。

表1 ITG模塊上不同加熱時間的標記率情況

前面提到，反應時間為10 min時，測得的標記率是42%，因為每次取樣在HPLC 進行檢測就需要大約10 min的時間，為了較好地與前面反應時長為10 min 的結果進行對比，此處沒有先測10 min 時間節點的樣品，而是先測量15 min時間節點的樣品，經過放射性HPLC檢測，其標記率是38%，說明在標記率的誤差范圍內增加反應時間沒有提高標記率。

對于10、20 和25 min 時間節點，分別取出約1 mL反應液放在室溫環境下等待檢測。因為每一個樣品的測量時間為10 min 左右，所以20 min 節點的樣品是在室溫下放置5 min后進行檢測的，10 min節點的樣品是在放置25 min 后進行檢測的，25 min 節點的樣品是在放置20 min后進行的檢測。1 mL的樣品液在從高溫的模塊上取下后，其溫度會緩慢降低，在這個過程中，雖然加熱停止了，但是標記反應仍然會繼續進行，造成除首個檢測樣品外的其他時間節點樣品的反應時長隨著放置時間增加而延長。所以對于10 min 節點的樣品，其有效的反應時間是在10～35 min 之間，這就解釋了為什么所檢測到標記率是60%。

從標記率的檢測結果可以看出，延長有效的反應時間，標記率會有所改善，但是，即使是對于最長的25 min時間節點的樣品，有效反應時間在25～45 min之間，其標記率也只是接近70%。

從這些實驗可以看出，在模塊上增加有效反應時間可以增加標記率，但是仍然沒有達到以前的標記率水平。為了增加混勻，嘗試了向反應管中吹氣，分別在反應開始、5 min和10 min的三個時間節點吹20 mL 空氣進入反應液，反應15 min，測量標記率為47%，比無吹氣混勻情形下的38%高出了約9%。取相同的反應液在恒溫混勻儀上反應，反應時間15 min，標記率為98%。從這里看出，獨立加熱器的混勻功能幫助了標記率達到了98%。但是，需要解釋是什么原因使得以前使用模塊就可以完成的反應，現在必須借助恒溫混勻儀才能完成。

2.6 pH環境

使用模塊時，不同的操作人員在具體操作上可能稍有不同，其中一步就是，是否把從淋洗液出口到反應管之間這段管線內剩余的鹽酸淋洗液吹入反應管，這段管線內可盛裝液體的體積為0.28 mL。同時，在鹽酸淋洗液的出口處有一段延長管，這個延長管是為了操作方便使用的，如果使用前這段延長管是空的，它也會殘留一部分的淋洗液，其體積為0.24 mL。按照這個推理，管線殘余會引起鹽酸淋洗液比正常的4 mL少0.52 mL。另一方面，也要了解如果鹽酸過多對標記率的影響。

按照前面pH驗證的方法，分別將鹽酸的體積在4 mL 的基礎上減少0.6 mL 和增加0.6 mL，使用pH計測量反應液的pH。鹽酸體積分別為3.4，4.0 和4.6 mL，取1.0 mL 醋酸鈉溶液，0.1 mL水（模擬前體水溶液體積），測量所得的pH 分別為3.89，3.61 和2.71。按照鹽酸和醋酸鈉溶液的比例，取340 和460 μL 的鎵淋洗液，100 μL 醋酸鈉溶液，2.5 μg/40 μL前體水溶液，在獨立的加熱器上95 ℃反應15 min，測量標記率分別為91%和42%。

可以看出，改變鹽酸的體積對標記率有影響，但是，按照估算的鹽酸體積，不會導致標記率減少到42%，反而是多加鹽酸，改變反應溶液的酸堿度更大，使標記率大幅度下降。所以，在模塊上的標記率降低不是來自殘留在管線里面的鹽酸。

2.7 對比模塊和無混勻恒溫混勻儀

為了進一步尋找原因，測量了在模塊和關閉混勻功能時使用恒溫混勻儀的標記率。提前預熱模塊和恒溫混勻儀至90 ℃，將1 mL 醋酸鈉溶液和25 μg/0.1 mL前體水溶液混合推入模塊的反應管，然后推入4 mL 鹽酸淋洗液，吹入空氣混合反應液。然后從模塊的反應管中用氣流推出1.5 mL 反應液到離心管，放在恒溫混勻儀上反應，反應10 min 后取下，各取20 μL 樣品在HPLC測試，結果顯示模塊上的標記率是98%，這個結果同之前在相同的裝置和條件下測得的42%的標記率完全不符合，見圖2；測量在關閉混勻功能時使用恒溫混勻儀的標記率是97%，兩者標記率在誤差范圍內基本相同；為了驗證，又再次取樣測量了在模塊上的標記率，結果是97%。

圖2 ITG模塊上不同日期所測量的HPLC結果

接下來于6月2日、3日、5日分別重復了三次在ITG模塊上的標記實驗，見表2，標記反應完全正常，產品的放化純都在99%以上，問題已經得到解決，但是需要對問題產生和得到解決的原因進行解釋。

3 討論

3.1 對問題來源的推測

按照本文開始對問題的分析，設計實驗對各種可能性進行排查，在這個過程中，問題解決了。通過進一步查看生產記錄，找到了問題可能的出處。68Ga標記的DOTATATE注射液的生產記錄如表2所示，4月13日，廢液活度有2.4 mCi，高于正常水平，只是經過純化后，放化純達到99.8%，仍處于正常水平，所以問題沒有引起注意；4 月14 日，產品的放化純為95.3%，低于正常的＞98%，引起了對標記問題的注意；接下來在4月21日、22日和24日連續出現異常。

表2 DOTATATE注射液04-01到06-05生產記錄

在發現問題之后，進行了一系列排查實驗，包括檢查反應液pH 與對比使用模塊和恒溫混勻儀的區別，發現使用恒溫混勻儀提高了標記率，所以從5月6日開始，使用恒溫混勻儀手動標記，同時每次記錄廢液、濾膜和C-18柱上的殘留活度。但是，即使是在使用恒溫混勻儀的情況下，在5 月6 日和5 月18 日，標記率也出現異常，廢液活度過高。最終，在5 月27日，在尋找問題的過程中發現在模塊上反應恢復了正常，經過重復驗證后，又改回使用ITG模塊進行標記。

通過檢查生產記錄和總結前面的排查結果，推測標記異常是由中轉瓶的鹽酸被輕度污染造成的。在相同時期，也在使用同樣的鹽酸淋洗鍺鎵發生器，利用ITG模塊生產68Ga-PSMA注射液，但是PSMA的標記沒有出現異常，而DOTATATE對反應的體系要求較PSMA更苛刻，所以出現了明顯的標記率降低，而這些又可以通過使用恒溫混勻儀獲得部分或者全部的補償。當標記率不能被完全補償時，就出現了在手動標記的情況下廢液活度過高；當標記率獲得全部補償時，廢液活度水平正常，所以推測是鹽酸被輕度的污染，還沒有達到完全使DOTATATE標記不上或者影響到PSMA標記的程度。

當用完了被污染的鹽酸，從備用瓶補充了未被污染的鹽酸，原來的問題也就解決了。因為要檢查鹽酸被污染的情況，需要特定的儀器設備，限于實驗條件，無法完成此類檢測。同時，因為沒有記錄中轉瓶鹽酸的具體補充日期，所以沒有辦法重復驗證此假設。

標記實驗之所以存在這樣一個潛在的問題，是因為每次取鹽酸的注射器在3月份之前是重復使用的，而注射器每次是伸進中轉瓶吸取鹽酸，當外部帶有少量鹽酸的注射器接觸到鐵質的屏蔽柜時，就有腐蝕并將鐵元素帶入中轉瓶的可能性，從而污染鹽酸。當注意到這個潛在的問題后，在3 月6 日就更新了操作規程，要求每次淋洗鍺鎵發生器都要更換注射器，使用新的注射器抽取中轉瓶內的鹽酸，避免污染。

4 月份發生的標記率異常，有可能是在更新操作規程后，有些其它實驗人員在鍺鎵發生器淋洗的過程中，仍然重復使用了抽取鹽酸的注射器，導致中轉瓶鹽酸被污染。因為是輕度污染，還沒有達到完全使DOTATATE 標記不上或者影響PSMA 標記的程度，另外進行DOTATATE標記的人員都已經在每次使用時更換注射器，所以在最開始也沒有把問題歸結為這個原因。

為了防止類似問題發生，實驗室規定鍺鎵發生器的淋洗只由常規操作人員執行，非常規人員不允許進行淋洗操作，確保每次抽取鹽酸的注射器只是一次性使用。從2020年6月份到現在，已經有一年的時間，沒有再出現過DOTATATE 的標記異常問題，問題得到了有效解決，這也從側面印證了對問題原因的推斷是正確的。

3.2 降低濾膜和C-18柱殘留的方法

另外，生產的DOTATATE 和PSMA 的注射液都是用1 mL 50%乙醇和5 mL 生理鹽水清洗C-18固相萃取柱和除菌濾膜后勾兌而成的，注意到對于DOTATATE，其在濾膜和C-18 柱的殘留活度要比PSMA高，通過增加淋洗液的體積，可以減少產品在濾膜和C-18柱上的殘留，增加產品的活度。

對于濾膜上殘留的活度，例如，在實驗中經過1 mL 50%乙醇和5 mL 生理鹽水清洗后，其殘余活度經測量為3.22 mCi，使用1 mL 50%乙醇再次沖洗濾膜，其殘留活度減少到0.596 mCi，再使用5 mL 生理鹽水沖洗濾膜后，其殘余活度進一步減少至0.067 mCi，有非常明顯的效果。

3.3 檢查流程

通過這一次的問題排查，總結了一份檢查的流程，以供相關人員參考，見圖3。一般來說，當標記率降低時，游離鎵就會進入廢液，首先發現的是廢液活度增加，同時進行質控時，因為純化過程中游離鎵清除不徹底，產品的放化純一般就會降低，這時應該首先檢查反應的標記率。前體一般一次性分裝許多小份，不至于互相污染，所以該流程圖沒有考慮前體的污染。更換鹽酸和緩沖液，使用備用鹽酸和備用緩沖液進行標記就是為了排除污染引起的標記率降低，一般來說，鹽酸被污染的可能性較大，所以先對其進行檢查，本文遇到的問題就是屬于鹽酸被輕度污染。如果排除了污染，標記率還是低，那就要檢查反應液的pH，如果pH異常，可能是鹽酸或者緩沖液濃度有問題，分別檢查它們的pH，進行必要的更換。核查pH通常是首先進行的排查工作，但是通過本文工作的經驗，可以將其放在排除鹽酸和緩沖液的污染之后進行，這樣或許可以提高排查效率。

圖3 標記問題檢查流程圖

前面的這些檢查都是在模塊上進行，如果不存在污染，反應液pH 也在正常范圍內，那就要考慮模塊的加熱系統是否出現故障，使用獨立的加熱器進行標記反應進行驗證。如果在上面檢查的過程中，發現了標記率恢復正常，在可能的情況下，利用標記率有問題的實驗條件和標記率正常的實驗條件進行對比實驗，確定問題的來源。

建議每次新配置鹽酸、緩沖液或者前體后，要進行標記實驗來驗證標記率正常，并進行記錄，方便出現問題后溯源。

4 結論

在生產68Ga 標記的DOTATATE 注射液的實驗中，放化純低于正常水平，經檢查發現標記率出現異常，通過分析問題的原因，設計了一系列的排查實驗，檢查在不同條件下標記率，對問題進行了溯源。經檢查，反應液的pH正常，前體的濃度足夠，不是問題的來源；在ITG 模塊和恒溫混勻儀上有顯著的標記率差異，進一步檢查發現，雖然不同加熱器的加熱效率不同，但是增加反應時間并沒有改善標記率，從而證明不是加熱效率造成的問題。

在進一步對比ITG模塊和關閉混勻功能的恒溫混勻儀對標記反應的差異時，發現標記率異常的問題消失了。通過檢查實驗生產記錄和總結排查實驗的結果，推測造成標記率異常的原因為淋洗鍺鎵發生器的鹽酸被輕度污染，而通過使用恒溫混勻儀，使標記率得到部分或者完全的補償。通過規范鍺鎵發生器的使用，此后再也沒有出現過類似情況，問題得到了有效解決。最后，根據經驗，總結了一份檢查流程，供相關人員在解決實際問題時參考。