新型標志物對ICIs在NSCLC應用中的預測價值

黃成亮，范賢明

西南醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科（瀘州 646000）

最新統計學數據顯示[1]，在世界范圍內，肺癌發病率位列第二，僅次于乳腺癌，死亡率居癌癥之首，2020 年肺癌新增人數達220 萬，死亡180 萬；在中國，肺癌依然是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，2020年新發肺癌病例82萬，死亡71萬，而2015年新發病例為73.3萬，死亡61萬[2]。肺癌新發和死亡人數增速驚人，嚴重威脅人們的生命，是名副其實的“頭號殺手”。腫瘤免疫治療，尤其是免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）的出現，使癌癥的治療取得突破性進展。對于非選擇人群，晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）客觀緩解率（objective response rate,ORR）約20%[3]，選擇人群的ORR 在50%左右[4]；免疫相關不良事件（immune-related adverse events,irAEs）相對獨特，嚴重者足以致命。盡管程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）和腫瘤突變負荷（tumor mutational burden,TMB)是目前臨床最常用的療效預測標志物，但預測價值不盡如人意，且臨床上尚缺乏有效的irAEs 預測性生物標志物。為了明確ICIs 治療NSCLC 的適宜人群，積極尋找新的標志物來預測其療效和irAEs迫在眉睫。

1 療效的預測性標志物

1.1 傳統生物標志物PD-L1和TMB的預測價值

1.1.1PD-L1 PD-L1 是程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1,PD-1）的主要配體，主要表達于腫瘤細胞和抗原遞呈細胞（antigen presenting cell,APC）。PD-1與PD-L1的結合可抑制細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell,CTL）對腫瘤細胞的殺傷作用而發生免疫逃逸，PD-1或PD-L1抑制劑能阻止兩者的結合，從而激活CTL，使CTL重新恢復殺傷腫瘤細胞的能力。KEYNOTE-024研究，Pembrolizumab對照標準化療，一線治療EGFR/ALK野生型、PD-L1 腫瘤比例評分（tumor proportion score,TPS）≥50%的晚期NSCLC 患者，結果表明，與化療相比，Pembrolizumab明顯延長了中位無進展生存期（median progression-free survival,mPFS）（10.3 vs 6.0 月，HR=0.50）和中位總生存期（median overall survival,mOS）（30.0 vs 14.2 月，HR=0.63）[5]；KEYNOTE-042 研究中，針對全人群和262 例中國受試者的亞組分析表明，對于PD-L1 TPS ≥50%患者，Pembrolizumab 組優于化療組，其中，中國患者mOS 明顯延長（20.0 vs 14.0月,HR=0.62）[6]。基于上述研究，FDA 和NMPA 均批準Pembrolizumab單藥治療PD-L1 TPS ≥50%的晚期NSCLC的一線適應癥。此兩項臨床研究表明，PD-L1高表達與Pembrolizumab 的療效正相關。Check-Mate-026 研究，Nivolumab 對比標準化療一線治療PD-L1 ≥5%的晚期NSCLC，結果顯示化療組mPFS略優于Nivolumab 治療組，未達到主要研究終點[7]。IMpower131研究，Atezolizumab聯合標準化療對比標準一線治療晚期肺鱗癌，無論PD-L1 是否表達，Atezolizumab聯合化療組的mPFS均優于單純化療組（6.3 vs 5.6 月,HR=0.71）[8]。OAK 研究，Atezolizumab對照多西他賽二線或三線治療IIIB/IV期NSCLC，觀察到即使PD-L1 表達陰性的患者，也能從Atezolizumab 治療中得到OS 獲益[9]，再次表明NSCLC 患者的生存獲益與PD-L1的表達與否并無相關性。另外，有研究顯示NSCLC 中PD-L1 的表達存在時空異質性[10]，不同活檢部位活檢組織中PD-L1表達不同，對ICIs 療效的預測也不同，這無疑再次給臨床應用PD-L1作為ICIs在NSCLC中的療效預測帶來巨大的挑戰。上述重要的臨床研究無不說明，將PD-L1作為ICIs在NSCLC中的療效預測標志物的價值有限。

1.1.2TMB TMB 是第二個被用來預測ICIs 在肺癌中療效的生物標志物，其定義為腫瘤基因組編碼區域每百萬堿基中的突變數量。以TMB為生物標志物，對CheckMate-026研究進行回顧性分析，結果顯示，在TMB高表達（TMB ≥243 mut/Mb）的患者中，無論 是mPFS（9.7 vs 5.8 月,HR=0.62）還 是ORR（46.8%vs 28.3%），Nivolumab組均顯著優于化療組，相比PD-L1，TMB更能有效地識別Nivolumab的獲益人群[11]。

CheckMate-227臨床研究，兩種ICIs聯合一線治療IV 期或復發的NSCLC，在TMB ≥10 mut/Mb 患者中，無論PD-L1 表達與否，Nivolumab 聯合細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4,CTLA-4）抑制劑Ipilimumab 顯著優于化療（mOS：PD-L1 ＜1%時，20.4 vs 11.2 月，HR=0.51；PD-L1 ≥1%時，24.4 vs 18.1 月，HR=0.77）[12]?；诖私Y果，有人使用TMB ≥10 mut/Mb對獲益人群進行分層，但其效能尚待臨床進一步驗證。

另外一項回顧性研究評估了血液TMB（bTMB）對Atezolizumab二線及后線治療NSCLC的療效預測價值，并對血液和組織TMB（tTMB）的一致性進行了分析，結果表明，在bTMB ≥16 mut/Mb 的人群中，Atezolizumab 組較化療組的mPFS 和mOS 均有提高，bTMB 與tTMB 的陽性和陰性一致率分別為64%和88%[13]。

上述三項研究似乎表明TMB 可以作為ICIs 療效的預測標志物。但是TMB作為ICIs療效預測標志物同樣面臨著挑戰。首先，TMB的閾值較難確定，不同研究所得出的TMB閾值不同。不同的TMB閾值會使ICIs 有效者與無效者之間存在較大重疊，這無疑會降低TMB 的應用價值。其次，TMB 低于上述閾值時，部分患者仍可以從ICIs治療中獲益，這一點無論是從臨床試驗還是實際臨床應用中均能觀察到[14-15]。再次，目前檢測TMB 的金標準是全外顯子測序（whole exome sequencing,WES），檢測一次的價格動輒過萬甚至數萬，檢測周期在數周以上，難以在臨床上普及。就目前而言，TMB作為標志物預測ICIs的療效尚需更多臨床試驗數據的支持。

1.2 新型標志物不斷涌現，挑戰傳統生物標志物地位

1.2.1腸道菌群 2015年《Science》率先報道腸道菌群（gut microflora,GM）與ICIs療效之間的關系[16]，隨后越來越多的證據表明[17-19]，GM 能夠影響ICIs 對多種實體腫瘤如肺癌、黑色素瘤、腎細胞癌等的療效。通過對已發表的GM與ICIs療效之間關系的研究進行回顧性分析，我們發現，在門（Phylum）的水平，腸道富含厚壁菌和疣微菌的實體腫瘤患者普遍對ICIs有更好的療效，而富含變形桿菌的患者表現出更差的療效，富含擬桿菌屬的患者對ICIs 治療則表現出混合相關性，即腸道富含某些擬桿菌的患者對ICIs的有更好的療效，而富含其他擬桿菌的患者則表現出更差的療效[20]。

Routy等[17]探討了GM及抗菌素對ICIs療效的影響，研究納入了249 例接受PD-1 抑制劑治療的NSCLC、腎細胞癌等上皮腫瘤的患者，其中69 例患者因感染在免疫治療前后使用過抗菌素，通過對患者的GM分析，發現PD-1抑制劑治療無效的患者腸道缺乏一種名為艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）的細菌，該細菌的相對豐度與PD-1抑制劑的療效顯著正相關；將PD-1抑制劑治療有效患者的糞菌移植給無菌荷瘤小鼠，小鼠腫瘤對PD-1抑制劑的敏感性增加，而將糞菌移植給之前PD-1抑制劑治療無效的小鼠，無菌小鼠則恢復對PD-1 抑制劑的敏感性；服用過抗菌素的NSCLC 患者較未服用的患者mOS 明顯縮短（8.3 vs 15.3 月，P=0.001），考慮抗菌素導致了GM紊亂，從而影響了ICIs的療效。日本的一項針對NSCLC患者GM與ICIs療效相關性的研究顯示[21]，GM的組成與ICIs療效密切相關，ICIs療效好的患者腸道乳酸桿菌（Lactobacillus），梭狀芽孢桿菌（Clostridium）和滑球菌（Syntrophococcus）較療效差的患者更加豐富，接受ICIs治療后，腸道乳酸桿菌和梭狀芽孢桿菌豐富的患者往往比低豐度的患者有更長的治療失敗時間（time to treatment failure,TTF)。對中國NSCLC人群的一項研究同樣表明[22]，GM的多樣性與患者對PD-1 抑制劑的療效正相關。該研究發現，基線時GM多樣性高的患者較多樣性低的患者有更長的mPFS；ICIs 治療有效的患者腸道富含Alistipes putredinis,長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）和普雷沃氏菌（Prevotella copri），而療效差的患者腸道富含未分類的乳球菌（Ruminococcus unclassified），且GM多樣性高的患者外周血出現特異性記憶性CD8+T細胞和自然殺傷細胞亞群的頻率更高。綜上所述，GM有望成為預測ICIs療效的新型生物標志物。

1.2.2腫瘤浸潤淋巴細胞 腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）指的是從血液遷移到腫瘤區域的免疫細胞，這些細胞具有識別和攻擊腫瘤細胞的能力，體外刺激擴增時主要由CD8+和少量的CD4+淋巴細胞組成。腫瘤組織中TILs的數量與免疫治療和腫瘤患者的預后密切相關，如果腫瘤組織TILs含量豐富，往往提示機體啟動了抗腫瘤免疫反應，預示著好的臨床結局，而TILs數量較少或TILs被耗竭，則預示著較差的臨床轉歸。TILs與腫瘤微環境（tumor microenvironment,TME），尤其是腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment,TIME）密切相關。根據TIME中TILs與PD-L1 的表達狀況，TIME被分為IV型，其中II型，即TILs與PD-L1均表達的腫瘤往往更容易從ICIs中獲益[23]。

耶魯大學陳列平團隊研究了25 例早期和35 例晚期NSCLC患者基線腫瘤組織中的TILs，發現了一種積聚在TME 中的新亞群，即CD8+TIL，他們認為NSCLC患者基線腫瘤組織中CD8+TIL的豐度與ICIs治療的耐藥性相關[24]。該研究提示了一種克服ICIs耐藥的策略。NSCLC 患者基線腫瘤組織中CD8+TIL的豐度或可以作為一種潛在的標志物來預測ICIs的療效。法國的一項回顧性研究[25]探討了TILs 與晚期NSCLC 患者ICIs 治療及化療預后的相關性。ICIs 隊列納入了221名接受Nivolumab治療的患者，并定義了患者腫瘤組織TIL計數≥10%密度為高TILs，否則為低TILs。研究結果顯示，高TILs 的發生率為22%，高TILs 組無論是mPFS（13.0 vs 2.2 月）還是mOS（未達到vs 8.4月）均顯著優于低TILs組，高TILs與客觀緩解率（overall response rate,ORR）和疾病控制率（disease control rate,DCR）密切相關（P＜0.001）。在該研究中，高TILs與ICIs的療效相關，提示TILs或可作為篩選適合ICIs 治療的NSCLC 患者的標志物。2020 年AACR 年會公布了一項基于TILs 治療晚期NSCLC 的I 期臨床試驗的研究數據，該研究納入了12 例接受Nivolumab 治療后疾病進展(progressive disease,PD)的晚期NSCLC 患者，研究者從這些患者的腫瘤病灶中提取TILs，在體外進行擴增后回輸到患者體內，大部分患者在接受該治療后，第一次復查胸部CT 時，腫瘤病灶直徑平均縮小38%[26]。該研究提示，TILs 不僅為NSCLC 患者在ICIs 治療后耐藥提供了一種比較有前景的治療模式，而且從側面證實TILs作為預測性生物標志物的價值。以上說明，TILs作為一個新興的ICIs 療效預測的標志物，對指導免疫治療可能具有重要意義。

1.2.3POLE 基因 POLE 基因的主要的功能是校正和修復DNA復制過程中的錯誤，避免或減少基因突變的發生，該基因發生突變后，正常細胞會逐漸累積較多的基因突變，累積到一定的程度，腫瘤就發生了。

浙江省腫瘤醫院張沂平團隊利用NGS技術分析319 例NSCLC 患者POLE 基因的突變狀態，結果表明，POLE 基因的突變率為2.8%，且均為腺癌患者，具有POLE 基因突變患者TMB 水平明顯高于POLE基因野生型患者（12.2 vs 7.8 mut/Mb，P=0.026）。此外，POLE 基因突變組的CD8+TILs 和PD-L1 的表達水平也均高于POLE基因野生型組。鑒于TMB、CD8+TILs 和PD-L1 與ICIs 療效的關系，研究者認為，POLE 基因突變可以作為NSCLC 患者ICIs 治療療效預測的潛在標志物[27]。

中山大學附屬腫瘤醫院徐瑞華團隊分析了47 721例泛癌種患者的POLE基因突變狀況，并探討了其與ICIs 治療療效之間的關系，結果表明，POLE 基因突變總體發生率為2.79%，具有POLE基因突變的患者mOS 顯著優于POLE 基因野生型患者（34 vs 18月，P=0.004），POLE基因突變可作為預測ICIs療效的獨立標志物[28]。

1.2.4循環腫瘤DNA 循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA），是指腫瘤細胞壞死或凋亡后釋放到血液循環系統中的DNA。

美國的一項臨床試驗探討了ctDNA 在NSCLC免疫治療療效預測的價值[29]，在開始治療不久，抗PD-1治療有效的患者體內的ctDNA水平明顯下降，而對PD-1 治療無效的患者體內的ctDNA 水平保持穩定甚至增加；兩組患者的mPFS 和mOS 存在明顯的差異，mPFS 分別為14.5 月和5.2 月（HR=5.36，P=0.007），mOS 分別是18.7 月和8.4 月（HR=6.91，P=0.02），患者ctDNA 的水平能夠有效預測ICIs 的療效，且ctDNA 能較CT 檢查提前8.7 周評估ICIs 的治療效果。ICIs 治療期間隨著患者體內T 細胞水平的升高，ctDNA的水平隨之降低，表明ctDNA可以作為一種生物標志物對ICIs 的療效進行預測，并且較常規影像學能更早的對療效進行預測。該結果得到另外一項臨床研究的驗證，研究者以不可手術切除的IIB-IIIB 期的NSCLC 患者作為研究對象，化放療后接受ICIs鞏固治療，利用ctDNA在ICIs治療前、治療早期及PD 后對微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）進行連續動態檢測來評估ctDNA 對ICIs 療效的預測價值[30]。研究中，ctDNA 陰性的患者有87.5%免于PD，而出現PD的患者在PD之前或PD時ctDNA 的檢出率為100%。因此，連續動態檢測基線、治療過程中對接受ICIs 鞏固治療的NSCLC 患者的ctDNA，是預測患者PD 的一種手段。由于ctDNA是一種無創的檢測手段，獲取容易，且與組織相比，更少受腫瘤異質性的影響，隨著ctDNA 檢測費用的不斷下降，ctDNA 有望成為一種比較有潛力地預測ICIs療效的生物標志物。

1.2.5其他腫瘤標志物 除上述標志物外，新的ICIs 療效預測標志物正層出不窮。利用全基因組甲基化芯片對NSCLC 患者的腫瘤組織表觀遺傳學特征進行研究，研究者發現了301個CpGs位點的甲基化水平與患者接受ICIs 的治療療效相關，驗證隊列證實DNA甲基化水平是PFS和OS的獨立預測因子[31]。通過WES 技術對79 例經ICIs 治療的NSCLC 患者的腫瘤標本發現，肝配蛋白A類受體（ephrin type-A receptors,EPHA）基因突變患者的mPFS（P＜0.001）和DCR（P=0.01）較野生型患者明顯延長[32]。通過對一線接受ICIs 單藥或聯合治療的37 例晚期NSCLC患者外周血肺癌自身抗體的篩查，研究者篩選出5種肺癌自身抗體p53、BRCA2、HUD、TRIM21 和NY-ESO-1 組成抗體組合，然后在129 例晚期NSCLC 患者中進行驗證，結果表明上述5 種肺癌自身抗體一種或多種陽性較陰性者有更高的mPFS（7.6 vs 3.3 月，P＜0.001）、ORR（44.4% vs 13.6 月，P=0.001）和DCR（84.1% vs 59.1%，P=0.002）[33]。因此，DNA甲基化、EPHA基因突變和肺癌自身抗體等或可以作為NSCLC ICIs 治療的療效預測標志物，而且各種標志物之間并非完全獨立，很有可能相互影響，當然，尚有其他的標志物正在研究當中。如何科學合理使用上述生物標志物來篩選最適合ICIs治療的NSCLC人群，有待進一步臨床驗證。

2 ICIs不良事件的預測標志物

ICIs 免疫治療的不良事件(adverse event,AE)往往不同于其他類型抗腫瘤藥物的不良事件，可以累及一個或多個不同的器官，其程度可以從無癥狀到致命。ICIs有可能導致T細胞攻擊人體正常細胞，導致一系列不良事件的發生，稱之為免疫相關不良事件（irAEs）。irAEs 可以表現為皮膚毒性、心血管毒性、內分泌毒性、神經系統毒性等涉及幾乎所有的器官，在ICIs治療期間或結束后均可發生。臨床上ICIs聯合用藥較單獨用藥更為常見，故irAEs更加復雜和嚴重。遺憾的是，目前臨床缺乏針對irAEs 的預測標志物。近年來，隨著ICIs 在NSCLC 的廣泛應用和相關研究的不斷深入，幾種指標有望成為irAEs 潛在的預測標志物。

通過對為數不多的GM 與ICIs 在實體腫瘤療效之間的關系的研究[34-36]進行回顧性分析，我們發現[20]，在門（Phylum）的水平，厚壁菌門（Firmicutes）與較高的irAEs 發生率相關（主要是腹瀉或腸炎），而擬桿菌門（Bacteroidetes）則與較低的irAEs 發生率相關。對于NSCLC 而言，腹瀉發生與否與ICIs 治療之前患者腸道菌群密切相關，在屬（Genus）的水平，與腹瀉組比較，無腹瀉組患者基線富含隸屬擬桿菌門的Bacteroides 屬、Parabacteroides 屬和隸屬厚壁菌門的Phascolarctobacterium屬，少含隸屬于變形菌（Proteobacteria）門的Veillonella屬[34]。

日本的一項回顧性研究納入了137 例接受ICIs單藥治療的晚期NSCLC 患者，分析了ICIs 治療前外周血自身免疫抗體如類風濕因子(rheumatoid factor,RF)、抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)、抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody,TGAb)或抗甲狀腺過氧化物酶抗體(anti-thyroid peroxidase antibody,TPOA)與ICIs治療發生irAEs的相關性。研究結果顯示[37]，上述任意抗體陽性患者的irAEs發生率明顯高于抗體陰性者（68%vs 40%,P=0.006），其中皮膚的irAEs 在抗體陽性（40% vs 18%,P=0.009）或RF陽性（47%vs 24%,P=0.02）的患者中更常見，甲狀腺功能減退者在TGAb 或TPOA 陽性的患者中更易發生（20% vs 1%,P ＜0.001），在RF 陽性的情況下，疾病PD或死亡的風險比為0.61。

一項單中心回顧性研究探討了NSCLC 患者接受ICIs 治療后疾病發生超進展的影響因素，該研究納入了74例NSCLC患者，其中25例發生超進展，通過對疾病發生超進展患者與未發生者進行對比研究，通過多因素分析發現，外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值≥3是疾病發生超進展的獨立危險因素[38]。該研究結果得到另外一項臨床研究的驗證，此項研究除中性粒細胞與淋巴細胞比值外，增加了乳酸脫氫酶對irAEs進行預測[39]。

由此可見，腸道菌群、自身免疫抗體和外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值有望成為預測irAEs 的新興標志物。

3 小結

肺癌已進入免疫治療2.0時代，目前臨床上使用最多的是ICIs，ICIs 給部分晚期NSCLC 患者帶來長期生存獲益的同時，也帶來諸多挑戰。其中，現有標志物對ICIs 療效的預測不夠精準和缺乏irAEs 預測標志物最為突出?，F有標志物的預測價值不可能像EGFR、ALK 和ROS1 等驅動基因對于NSCLC TKI 療效的預測那樣精準，這一現狀必然使得ICIs 難以像靶向治療那樣具有針對性。新型標志物的出現給肺癌患者ICIs 治療帶來無限的希望，也給臨床醫生帶來無限的期待，但尚待臨床進一步驗證和完善。正因如此，將促使廣大的專家學者繼續探索前行。